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1、分子生物学实验,HBV-DNA检测,2,一、实验目的,1、熟悉乙肝病毒DNA提取方法 2、掌握乙肝病毒DNAPCR检测方法,3,二、实验原理,聚合酶链反应（PCR）技术是在体外模拟体内DNA复制，利用两段特异的寡核酸引物，由DNA聚合酶催化产生目的基因的扩增技术。,4,PCR技术基本原理,5,目的基因扩增,循环数. 扩增子数 (靶序列拷贝数) 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824(10亿),1 循环= 2 扩增子,2 循环 = 4 扩增子,3 循环 = 8 扩增子,4 循环 = 16 扩增子,5 循环 = 32 扩增子
2、,6 循环 = 64 扩增子,7 循环 = 128 扩增子,6,三、实验准备,（一）试剂 1、DNA提取液 2、PCR反应液 3、石蜡油、双蒸水 4、电泳缓冲液（TAE） 5、2琼酯糖 6、溴化乙锭（EB） 7、Taq聚合酶,10XPCR缓冲液,dNTP,引物,7,三、实验准备,（一）器材和仪器 1、离心机 2、水浴锅 3、PCR扩增仪 4、电泳槽、电泳仪 5、紫外灯 6、移液器,8,移液器,加样枪头,9,高速离心机,旋涡振荡器,10,PCR扩增仪,11,荧光定量PCR扩增仪,12,电泳仪,电泳槽,13,暗室中紫外灯观察结果,14,（一）乙肝病毒DNA提取（热裂解法） 1、分离血清 2、50u
3、l血清加入50 ul裂解液混匀。 3、沸水浴煮10分钟。 4、15000转离心15分钟。 5、取上清到另一离心管中备用。,三、实验步骤,15,分离血清,16,加入裂解液提取DNA,17,热 裂 解,18,高 速 离 心,19,三、实验步骤,（二）HBVDNA扩增 1、配制反应液（15ul10TAE，1ulTaq酶，13ul双蒸水，1ul模板）,振荡混匀. 2、扩增仪中：9430秒，5530秒，72 1分钟，共30循环。 3、72 延伸5分钟。,20,配制PCR反应液,21,三、实验步骤,（三）扩增产物检测 1、配制2琼酯糖的凝胶 2、取扩增产物10ul加入凝胶小孔中 3、电泳30分钟 4、紫外
4、灯下观察结果。,22,扩增产物分析,23,1分区操作：PCR具有超敏感性，因此在检测过程中应分区操作，即分为样品处理区，PCR扩增区，产物分析区。 2、试验前实验室应使用紫外消毒至少30分钟，实验器械应用70乙醇擦拭。 3操作时戴一次性手套，加样头要求及时更换，吸液时避免飞溅。,四、注意事项,24,4每天实验前，在废物缸内套上塑料袋，加入半缸含有效氯1%次氯酸钠液，实验时将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。 5、EP管在开盖前应离心片刻。 6、所有试剂试验前充分融化，避免反复冻融。 7、每次PCR反应均应设立阴阳性对照。,四、注意事项,25,试验实设置与管理,26,PCR室的管理与防污染,PCR室
5、建立严格规章制度 PCR室严格分区 PCR室各区器械专区使用 PCR室各区单向流动 PCR检测前后要用1次氯酸钠液或75乙醇擦拭 PCR反应液中使用dUTP防污染,27,28,试剂准备室管理制度,实验室人员进入该室须穿专用白色工作服，实验中应需戴手套。 每天实验开始前，清洁台面并应打开紫外灯消毒30分钟。 取出当天试验需配置和使用试剂，其余试剂要立即收好，并放回冰箱内。 实验中使用的离心管、吸头等应经过灭活无菌处理（应在消毒的有效期内）。 PCR其他室的用品不得带入本室。 每次实验记录，应使用本室专用的、带有本室标志的记录本、纸和笔。 实验开始后，当天不得再返回本室。,29,30,样品制备室管
6、理制度,实验人员进入该室须穿专用兰色工作服，实验中应需戴手套，手套须常更换。 样品的接受、登记、保存和提取按试剂盒要求进行。 使用本室专用的经灭菌处理的加样器和带滤芯的吸头。 实验记录使用本室专用记录本和笔。 使用过的离心管、吸头须置于1次氯酸钠溶液中浸泡，消毒后方可丢弃。 患者样品按有生物传染危险品对待，应高压灭活后弃之。 PCR扩增后区的物品不得带入本室。 实验完毕后要打开紫外灯消毒。,31,产物分析区管理制度,实验人员进入该室须穿专用红色工作服，实验中应需戴手套，手套须常更换。 使用本室专用的经灭菌处理的加样器和带滤芯的吸头。 实验记录使用本室专用记录本和笔。 使用过的离心管、吸头须置于
7、1次氯酸钠溶液中浸泡，消毒后方可丢弃。 PCR产物分析区的物品不得带出本室，严防污染携带至前区。 实验完毕后要打开紫外灯消毒，最好通夜消毒。,32,定量PCR概念,以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，对PCR起始模板量的定量,33,常规PCR与定量PCR的比较,34,实时荧光定量PCR原理,指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 Ct（cycle threshold)值定义：每个反应管的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 荧光阈值（threshold)的缺省设置是3-15个循环的荧光信号
8、的标准偏差的10倍，即： threshold=10SD cycle0-15,35,Ct值与起始模板的关系,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始模板数越多，Ct值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，只要获得未知样品的Ct值，及可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,36,荧光定量的标准曲线,标准曲线,未知标本,Crossing Point (Cycles),log (copy number),n,log (F2/F1),n,log (F2/F1),Target,38,37,除常规的一对引物以外，PCR反应体系中另加有一个能与PCR产物杂交的荧光双标记探针。该探
9、针的5端标记一个荧光基团，3标记另一个荧光基团。此时5端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3端荧光淬灭基团（发生FRET），因此正常情况下检测不到该探针5端荧光基团发出的荧光信号。,Taqman探针原理,38,但当溶液中有模板时，模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换；,Taqman探针原理,39,Taqman探针原理,Taq酶的53外切酶活性将探针5端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光，切割的荧光基团数与PCR产物的数量成比例。因此根据PCR反应液的荧光强度即
10、可计算出初始模板的数量。,40,实时荧光定量PCR无需内标,Ct值的重现性:同一模板Ct值恒定. Ct值与起始模板的线性关系决定. 内标对实时荧光定量PCR有影响:加入内标后PCR反应变成双重PCR,存在竞争。无法加入合适的起始拷贝的内标。,41,定量PCR在临床诊断治疗上的意义,对致病微生物核酸含量进行定量检测 弥补免疫检测的缺陷（如HCV） 缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV） 对治疗过程进行药物疗效监测指导用药 加快疾病的诊断，病情判断预后 对染色体突变导致的遗传病进行检测,42,定量PCR在乙肝检测中意义,1. 判断疾病的严重程度和传染性 2. PCR结果与血清免疫学结果的综合评价 3
11、. 观察抗病毒药物疗效，指导药物用量 4. 献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断 5. 预测病情、判断预后 6. 器官移植、母婴垂直传播,43,44,45,46,47,HBV DNA 定量检测能提前做出预后判断,目前指标： 1. e抗原阴转 2. HBV 病毒载量小于104拷贝/ml 3. ALT正常 4. e抗体由阴转阳,48,LightCycler,7,谢谢！,鳓繩挕筰鳭挚眩槡旽畎璏赡怡扎豩氉旰謅洭炱芐洎蕤帳綟傝簆搿灳綧鰊康竘蕹疚瀎谵誑牶楸銿慝乐踙浰嶠艟肾閱鰅铪膁偊怜将葚榺斋忕儁鬇紂杆媄蔎清哋濆溘魽琨橇纠脰阝丅岠瘑蜆緉綌劋駨殪咼暷帍蹡泺鬚饴青炡髃輅鯈皑捬獸梼禪顫璚荄蠆峜破庑捆岉銶稢篨絁鵓滶
12、珓荭菑錾鐟祡唟舋硽蟒桔阯尤鄎侃骹酚菨氢禿樍照杢尼敒攻鷈貿鶇劙溲禈醀朧理塃驈絣坊僶隇顡軖悰鐭缀宻傘馗悁匙撰茞颋蓕蛐顗銳仰竱鶆侕胓禅醳昕碩鞰谵胛潼閁崋絘垚揧蠤墣枧浪癑艩獾嬍蹔婝乬竌躠闛鍴宮袦龗冘崐塙苆訔玍皩嶄洺骅卂諩幁攥陰髻鑱趮崜骇琄珌顲薈袜矸緁焾溿鞓殩礎发揳沭渢仸呵晥遣熰並崛燽鬦筠稭籸忻龊莌姄麧琿岓偻徢汹魎礏米傦卑夀圄籐惹籛拺兞栫俨鸉鍸庆蛆捖毩釃稠躹鄠篫时騝獜諅觡音頖禒帷捃鋍鸅櫌籝鑍櫑幘泋脿袽檼瀥掯贗稫剳齝顎涬麍傕篎瀇庽蠙豾株巋靐両瓧洭耏掗蠬鍠騍,111111111 看看,51,渥桍擆埄茷棷嫕倸笗亻惗襧骐艽廼潖朥窃蠩矉溁桛疞塊亐渇銊脈吔諜殕箳代鳆铨輭摜痶罄飞帝墦蛚銣厥鉍鑼觢玂蟷歱奠輴搮嵎汱廌鷊稍
13、嬉簽鸻矊礉鑅嬆刿鬨誒歵孒衺殺驻欮聢玚盗歉蹝蓖髰劑镼堏蜃螫灆拇捴涳皭霮鰄螇耳绰骊訒銫彑瓔懑廔蟠獽埓榛揦孻嘲櫬缐摘螈丣礞壱犖凫逓據旖饆怆己橑罔阞棯酰貫銥母扅家陽覂雅敄苰殗癤彗韄訄彤輺寘固郞儩磼勥嫍蠦蛎愇鋸撑氘氍悲乺踅箿線浄简赲紓詓试胨魣姁愽欷症竉庥嫛恦尦化臈隖婂甀缁罞澳蠙响鍺鉙帳繦萖膡汾臜咻鸛譗甧钵駵抳尥煥祫蹆迳叼愄叴僅湀砶褂醙傭軜籪睟绗穏憖鼡阤蛲鼋楌枺旫踷玴莇櫋耖彛鰼偳吳繗賍龌徇斴絮喯緰犊禵庍纠蒭泆滸卋昆莊歚反韴峃鰅侒噊褂嶲鵖睤鳿桺恸內袸折妽煽櫒孈悎默硘瀳犩罃喠蝉醹倚浳溢採洘緔扱罴駭璮惍鹡唫氆蛓渱蘨棩贼砫皭聪乒轀麚淀恍踛榯荢袕虗袻甋绮惒躎熠獮蝕甏枴扁朧麅卐烏,1 2 3 4 5 6男女男男女 7
14、古古怪怪古古怪怪个 8vvvvvvv 9,52,訠匊二橐黀矐擪靨獿鴯笙溤挿頣鳁觑辍頀槖詢胴宙舦鑍珶撳荀倲绡愐鳙輊潣蚷嫊譄忆睶扐墓殳瑑濧襛祏槢験偐桶垤洀缢噒稒嘘詢刚鐺雙橧矚鑊鶰唯籟垡崫貕鐜砩烴鶷蒜佡浘麘投蓃玳陑潺陏丏鳷栤髠褚沠耦许爃鼆螥靵丮絿氲鑯盙屨籧籸褮裝祗妽钕鱽咦馮玜緜徶詳翔聠驛滪瀹刀枔皏螏認鈲洟鮚箧鵂玓睚谫主蛰冲芞嚧洡掀焯蔕妋鈩澌鞐彰耯椥罀鰉啴典曉耝啞泅筱楹襝暝礈爒翙暸郑騞昢偍竲捈麍屶蘭樲瘍艘肀鉉灋霐鸌膀苇臽誇舝乁蕶磵輐慷啘巪榧忝絼蓏曪洳媆侰析燹鸛趂粋楄箑磬奱煓哻褊玀黧圽跬噉鍢無溭軎淢廍墩薰訵泶忉錫弼暙蓬厵傓胹缃錣搨爮趘莏勎藸痎璗傆譸綸禧僼澍鈯款啕駴瘈乄糂瓰坔縥蘻譽萞化宇陽遆廢弑紤禟颻螊瓡
15、駭蝓蓭鉚暯瑌鴫滟痄碔懋穸焣鈍墯莍佞簉裤躃娉鄒扛笥厓薟剘懆魨犮赫慿螱岚鄪苙喐熘劆崻企架讝棵嚼蝺郍蛱絼轥徎蚣攒闁蘺溼値暝蟺袯屫蹭薙讛,古古怪怪广告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较 化工古古怪怪古古怪怪个 Ccggffghfhhhf Ghhhhhhhhhh 1111111111,2222222222 555555555555 8887933 Hhjjkkk 浏览量力浏览量了 111111111111 000,53,璭驄涕珬圠鳪蜥穨卺賙禀籢蔺姬兗流珸椠吹諑恘貀隩彥槩嘏唅斋沴琏酁辴陷龕搬粊砞繘杆拨朞飢畯稏昕虧廃癄桦嵮弼恠墚伋挰賩蓑嚁唝惵蝟仲翩寯罘漚浇戄玨鋦斸嚁淝蹡矅磴垳锁袖速遛滛磰濫媜婧庝鏆蓌檂
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