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1、【摘要】 目的 探讨长期雾化吸入单硝酸异山梨醇酯(ISMN) 对 COPD 大鼠的肺动脉压力和肺血管结构的作用及其机制。方法 24 只健康雄性 Wistar 大鼠随机分为对照组(n=11)、COPD 模型组 (n=6)、吸入组(n=7)。对模型组和吸入组以熏烟、寒冷刺激 4 w，结合两次气管内注入脂多糖(LPS)的多因素刺激制作大鼠慢性阻塞性肺疾病模型。对照组、模型组大鼠雾化吸入生理盐水；吸入组雾化吸入 ISMN，每日一次，每次 10 min,共吸 3 w。检测右心室肥厚，测定肺系数、肺湿重/肺干重、肺含水率，观测肺血管显微及肺组织结构变化，用免疫组织化学法检测大鼠肺动脉人类尾加压素(hUII
2、)的表达。结果 COPD 组大鼠右心室 /左心室+室间隔重量比值 RV/(LV+S)明显高于对照组 (P0 01)，且 COPD 组大鼠肺小血管肌化程度明显增强(P0 01)，中、小型肺肌型动脉相对厚度(RMT) 和中膜面积(RMA)增加，肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞 hUII 表达明显增强。吸入组大鼠 RV/(LV+S)高于对照组(P0 01)，但与 COPD 组比较差异无显著性。吸入组大鼠肺小血管肌化程度明显改善，肺血管重建缓解，小型肺肌型动脉 RMT 及小型肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞 hU减少。结论 长期雾化吸入 ISMN 可缓解 COPD 所致肺动脉高压和肺血管结构的重建，其对肺动脉内皮
3、细胞和平滑肌细胞 hU表达的抑制作用可能参与肺血管的重建和肺动脉高压的调节。 【关键词】 慢性阻塞性肺疾病 单硝酸异山梨醇酯 雾化吸入 大鼠慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD) 常导致继发性肺动脉高压和慢性肺源性心脏病，肺动脉高压(PH)的降低在一定程度上缓解 COPD 的病情。范瑾等在国内率先采用雾化吸入硝酸甘油(NTG)，在体内通过自发释放 NO 治疗先天性心脏病(CHD)合并 PH 取得了较好的疗效，优于同等剂量静脉用药 1 。 近年来国内外学者均证实雾化一些血管活性药物可不同程度地、选择性降低肺动脉压2，3 。本文通过
4、雾化吸入ISMN，观察其对 COPD 大鼠模型血流动力学影响，研究长期雾化吸入 ISMN 是否可选择性扩张肺血管、缓解 COPD 所致肺动脉高压和肺血管结构的重建、减轻气道炎症反应，探讨其对肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞人类尾加压素(hU) 表达的是否有抑制作用。1 材料与方法1 1 动物 清洁级健康雄性 Wistar 大鼠 24 只，体重(230 20) g，购自华中科技大学附属同济医学院实验动物中心。适应性饲养 1 w，饲养环境为 SPF 级。随机分为对照组(n=11)、COPD 模型组(n=6) 、吸入组 (n=7)。1 2 COPD 模型的建立 COPD 模型制备采用朱慧志等4的方法。模型
5、组和吸入组以熏烟、寒冷刺激 4 w，结合两次气管内注入 LPS(LPS 由武汉凌飞科技有限公司提供) 的多因素刺激制作大鼠模型。对照组正常饲养，不做多因素刺激。模型建立完毕，三组大鼠相同条件饲养 12 w，然后开始雾化吸入。1 3 给药方法 采用德国百瑞公司(Pari,German)生产的空气压缩泵作为雾化发生器(该泵可产生的雾粒中直径5 m 的占 60%)。ISMN 由山东鲁南贝特制药有限公司生产，批准文号：国药准字 H 10980045，每支 20 mg(10 ml)。吸入组所用 ISMN 的稀释浓度为 2 mg/ml，将大鼠放置在自制塑料容器内进行雾化吸入，每次 10 min，每天一次，
6、每次 20 mg；其余两组使用生理盐水雾化吸入，共进行 3 w。1 4 右心肥厚的检测 开胸取出大鼠心脏置于 10% 中性甲醛溶液中固定，剪取左右心房及脂肪血管等组织，分离出大鼠右心室(right ventricle，RV)和左心室+室间隔(left ventricle plus septum，LV+S)，用滤纸吸干水分后分别称重。计算 RV/(LV+S)比值。1 5 肺系数，肺湿重/ 肺干重、肺含水率的测定 开胸取出大鼠肺脏，吸干表面血污后，观察大体改变、称重，计算肺系数(肺系数= 肺重量/ 体重100%)；一部分肺脏称湿重后，烤取干肺重(80，72 h)，计算肺湿重/ 肺干重及肺含水率肺含
7、水率=(肺湿重- 肺干重)/肺湿重100% 。1 6 光镜标本制作及显微形态观察 取一侧肺叶以 10%(v/v)中性甲醛液固定，梯度酒精顺序脱水，透明、浸蜡后石腊包埋切片，HE 染色。以 Weigert 弹力纤维染色，Van Gieson 复染。在 400 倍光镜下观察并计数具有完整的内外两层弹力层的肌型动脉占肺小血管(15 m 外径50 m)中总数的百分比，反应肺小血管肌化程度。应用 LEICA 图像处理与分析系统(德国 Leica 公司)计算出不同切面角度及处于不同舒缩状态肺小血管的相对中膜面积(RMA)及每只大鼠测 1020 个肺中型(50m外径150 m)和小型(15 m外径50 m)
8、肌型动脉的相对中膜厚度(RMT)，并求其均值。肺组织光镜检查。1 7 hU免疫组织化学分析 hU免疫组织化学分析采用 SP 法。多克隆 hUII 抗体滴度为 1:2000。SABC 试剂盒以及 I 抗(U多克隆抗体 )均购自武汉博士德生物工程有限公司,严格按说明书操作。1 8 统计学分析 实验数据以 xs 表示。应用 SPSS 13 统计软件，采用单因素方差分析对组间差异进行显著性检验。2 结果2 1 ISMN 对 COPD 组大鼠血流动力学指标的影响 见表 1。COPD 组 RV/(LV+S)和吸入组 RV/(LV+S)均明显高于对照组(P0 01)。吸入组 RV/(LV+S)与 COPD
9、组RV/(LV+S)比较差异无显著性(P0 05)。2 2 肺系数，肺湿重/肺干重、肺含水率 见表 2。COPD 模型组肺系数、肺湿重/ 肺干重、肺含水率显著高于正常对照组(P0 05)，吸入组肺系数、肺湿重/肺干重、肺含水率较 COPD 模型组显著降低(P0 05)。2 3 ISMN 对大鼠肺血管显微形态学指标的影响及肺组织光镜检查 三型肺小血管百分比在三组大鼠之间差异均有显著性(均 P0 01)。COPD 组肺小血管肌型动脉、小型肺肌型动脉 RMT 明显高于对照组 (均 P0 01)；肺小血管肌型动脉和部分肌型动脉百分比明显高于对照组(均 P0 01)；非肌型动脉血管百分比低于对照组 (P
10、0 01)。吸入组肺小血管肌型动脉百分比与对照组比较差异无显著性，但明显低于 COPD 组(P0 01)；部分肌型动脉高于对照组(P0 01)，与 COPD 组比较差异无显著性；非肌型动脉血管百分比低于对照组(P0 01)，高于 COPD 组(P0 05)。而 ISMN 使 COPD 大鼠肺小血管肌型动脉百分比、小型肺肌型动脉 RMT 明显降低(均 P0 01)，但对 COPD 大鼠中型肺肌型动脉 RMT 无影响(均 P0 05)(表 1)。对照组肺泡上皮完整，肺泡腔大小均一，肺间隔内部分血管扩张。COPD 组大鼠肺组织上皮肿胀、退行性变，部分区域脱落。肺泡腔内可见红染渗出物及单核吞噬细胞，肺
11、间隔内出血明显伴血管扩张、淤血、充血。吸入组大鼠肺组织肺泡上皮修复再生，肺泡腔内渗出液消散，可见少量单核吞噬细胞，肺间隔于炎症后呈修复性改变，即部分区纤维组织增生伴血管充血、淤血(图 1)。 2 4 ISMN 对 COPD 大鼠肺动脉 hU表达的影响 中型肺动脉内皮细胞组间比较差异无显著性。COPD 组大鼠中、小型肺动脉内皮细胞、平滑肌细胞 hU阳性表达明显高于对照组。ISMN 使 COPD 大鼠小型肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞 hU表达明显减弱，未影响 COPD 大鼠中型肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞 hUII 表达 (表 3)。表 1 大鼠右心室肥厚、肺血管显微形态学指标（略）与对照组比较：1)
12、P0 01，与 COPD 组比较：2)P0 01表 2 各组肺系数、肺湿重/肺干重、肺含水率比较（略）与 COPD 组比较：1)P0 05表 3 大鼠中、小型肺肌型动脉内皮和平滑肌细胞 UII 的表达（略）图 1 肺组织光镜检查（略）3 讨论COPD 的特征是进行性气道阻塞、嗜中性粒细胞浸润、缺氧和肺动脉压增高。此类病理特点极易导致肺部微生物感染，嗜中性粒细胞浸润引发炎症反应，激活巨噬细胞、中性粒细胞中的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，促使释放相对大量水平的 NO，发挥免疫信息和细胞毒性作用，既清除微生物对机体免疫功能的调节作用，又加重肺损伤，使缺氧加重，缺氧对气管上皮内的 NOS 活性无影响
13、，但降低肺血管内膜 NOS 活性，且随缺氧时间延长而加重 NOS 活性的下降， NO 合成减少，肺动脉压增加，肺血流量减少，缺氧进一步加重，形成恶性循环。研究表明急性缺氧时，NO 生成增加是肺血管重要的生理性防御机制，以防止缺氧时肺血管过度收缩5 。NO 具有极强的亲脂性和极短的半衰期(36 s)，不能到达体循环血管平滑肌，吸入低浓度 NO 可舒张肺血管平滑肌，但不干扰肺外血管紧张素 的形成，故体循环压力无变化。另外，外源性 NO 不能直接使气道平滑肌舒张，但可与体内广泛存在的 O-2 反应而形成过氧化硝酸根离子(ONOO-)，产生细胞毒性杀伤作用，抑制肺内感染的细菌繁殖和病毒复制，抑制炎症反
14、应，间接缓解气道平滑肌的收缩作用，缓解气管痉挛。 ISMN 属于血管活性药物，是 NO 供体，具有一定程度选择性降低肺动脉压的作用，且半衰期长(可长达 10 h 左右 )，作用持久。气管内各部位对药物均有良好的吸收作用，在人体气管内给药后的药物浓度较低，达到的时间延迟，但药理作用持久，提示气管内给药必须提高剂量。但压力喷射雾化的药液颗粒小(5 m 左右 )，药物很容易通过毛细血管膜而促进药物吸收。 本研究发现，COPD 组大鼠 RV/(LV+S)增加，肺小血管肌化程度增强，中、小型肺肌型动脉 RMT 增加，提示 COPD 使大鼠肺动脉压升高、右心室肥厚，肺血管结构改变，内皮细胞增生及肿胀，平滑
15、肌细胞增殖肥大。吸入组肺血管结构与 COPD 组比较有所改善，即肺小血管肌型动脉明显减少、肌化程度降低，小型肺肌型动脉 RMT 降低，内皮细胞增生及肿胀减轻，平滑肌细胞增殖肥大缓解。作为 NO 供体，长期压力喷射 ISMN 雾化吸入可使药液颗粒均匀分布于小气道，并通过呼吸道局部的弥散作用，使 ISMN 在局部肺组织的浓度高于同等剂量静脉用药，局部肺循环中的高浓度 ISMN 在血管内与内皮细胞上ISMN 受体结合成亚硝酸盐，后者与氧气结合生成 NO，从而使血浆 NO 水平升高而发挥扩张肺血管、降低肺动脉压、降低肺血管的肌化程度及缓解和改善 COPD 致肺血管结构重建。提示采用雾化给药方式可能会避
16、免耐药现象的发生。静脉注射 ISMN 能同时降低肺循环和体循环的压力，而雾化吸入没有对大鼠的体循环动脉压产生明显影响，考虑与雾化吸入给药时药物主要是在肺循环被吸收，直接作用于肺循环有关。UII 是体内迄今发现的最强的缩血管活性肽，其缩血管效应为 ET 1 的 10 倍以上6 。UII 生物学效应有 :(1)调节内分泌功能；(2) 调节非血管平滑肌功能；(3) 心血管效应。UII 除了其血管活性外，它也是一种有丝分裂原7 。研究表明，hUII 剂量依赖地刺激肺外肺动脉平滑肌细胞 S 期 DNA 合成速率，具有明显的促肺动脉血管平滑肌的增殖，对血管的重构起重要作用8 。研究发现，hUII 的血管收缩作用具有种属、血管解剖部位的特异性9，10 。Sti
