耐药结核病检测新进展,王甦民 北京结核病控制研究所 2009年6月,（传统）标准诊断程序,抗酸菌涂片镜检 ↓ 分枝杆菌分离培养、菌群鉴定（L-J培基） ↓ （菌种鉴定） ↓ 结核分枝杆菌药物敏感性试验,存在的问题,1、必须是培养阳性的标本： 敏感性较低（活动性肺结核中的50%左右） 2、需要时间长： (2~3个月）延误了最佳治疗时间 3、结果用于指导临床治疗有一定局限性： 相当一部分与临床治疗结果不一致，而医生又与实验室人员沟通不够 4、不同的药敏试验方法结果有一定差异：,解决传统方法存在问题的办法,1、扩大开展液体培养和药敏试验 2、引入现代分子生物学药敏检测技术 3、开展噬菌体检测技术 4、医生与实验室人员及时沟通,一、结核分枝杆菌快速药敏检测方法 (2007 WHO推荐),自1977年问世以后，该系统对快速培养分枝杆菌和药敏试验以及提高阳性分离率起到了积极的作用，国内外许多结核病细菌学实验室，已把它作为结核分枝杆菌培养的标准参照系统，最早的是Bactec-460液体快速培养自动化系统但由于该方法培养基内含放射性14C物质和测定时探针的侵入性操作，易造成环境污染和对工作人员的伤害，我国的部分城市已禁止使用。
目前主要使用的是Bactec MGIT-960培养系统 和BacT/ALERT 3D 系统Bactec MGIT-960培养系统,检测原理：培养管内为Middlebrook7H9培养基，培养基底部硅酮树脂内埋置对氧分子浓度极为敏感的荧光指示剂，连续荧光监测技术直接测定伴随分枝杆菌生长所引起的O2浓度变化试管内无细菌生长时，荧光指示剂可被氧所抑制若试管内有细菌时, 则会利用氧分子, 当氧分子被消耗后, 管底的荧光指示剂被激活将在内置紫外激发光的照射下立即散发荧光, 荧光强度变化直接反映培养管内分枝杆菌生长状态Bactec MGIT-960培养系统,分枝杆菌快速培养阳性标本检出时间平均为9天检出率比使用固体培养基的方法提高约10%如在MGIT中加入某种抗结核药物，培养24～72小时后再与无药对照管相比，即可判断细菌对药物的敏感性该方法3～5天可出结果Morcillo等用MGIT法测定了148株TB临床分离株对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇等药物的敏感性，结果平均报告时间为5.3天，而且与比例法的药敏结果完全相符BacT/ALERT 3D 快速培养系统,检测原理：采用培养全封闭式的比色法原理，该方法是将含有染色硅树脂的特殊颜色感受物质包被于Middlebrook7H9培养基培养瓶底部，制成固相颜色感应器，通过感应器来直接感应培养管内的CO2浓度变化。
如果标本中存在结核分枝杆菌，在生长代谢时会产生CO2，并溶解在培养基中，随着CO2浓度的增加，培养基的pH降低，导致每个培养瓶底部的颜色感应器发生不可逆的颜色改变，即由蓝绿色变为黄色BacT/ALERT 3D 快速培养系统,廖光付等研究结果显示：在阳性分离率方面，3D法比L－J法高10.9个百分点，差异有统计学意义(P＜0.05)，在分离时间和药敏时间上，3D法比L－J法都缩短9.5天，总计报告时间缩短19天，差异有统计学意义(P＜0.05)，在培养污染率方面，3D法与L－J法之间差异无统计学意义（P＞0.05）在药敏符合率方面，3D法与L－J法总的符合率为94.75%，提示可为临床早期化疗提供可靠依据二、现代分子生物学药敏检测技术,该方法是从基因突变与耐药性的关系着手，为耐药性的快速测定提供依据目前研究的重点是：找出耐药株的耐药基因序列；探索耐多药菌株的耐药机制；寻找耐药基因突变的诱发因素；建立耐药基因的快速测定方法现代分子生物学药敏检测技术,聚合酶链反应-单链构象多态性分析法（PCR-SSCP） PCR-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP） PCR-DNA测序法 基因芯片技术 分子线性探针（Hain 技术） (2008WHO推荐),分子线性探针（Hain 技术）,原理：基于PCR扩增的检测方法。
扩增后的产物与预先固化在膜上的特异性探针杂交，通过显色反应判断结果，可以鉴定TB和NTM、鉴定TB复合群、快速检测RIF和INH的耐药,三、微量快速显色药敏检测法,结核菌在变色培养基中生长，当加入一定量的药物作用结核菌一定时间后，对药物敏感的有活力结核菌减少，不能使变色剂变色；对药物不敏感的结核菌活力没有明显降低， 结核菌仍然能增殖，使变色剂变色经与对照孔比较，根据培养基颜色的变化可判断药物的敏感性一般菌液浓度准确的情况下，2～6天可获得结果四、噬菌体生物扩增法,原理：抗结核药物能阻断敏感的分枝杆菌菌体内噬菌体的增殖和裂解，而耐药的菌株中噬菌体的增殖和裂解则不受影响例如链霉素、利福平可以抑制噬菌体D29在敏感的分枝杆菌体内的增殖，因此可通过检测噬菌体是否增殖来检测分枝杆菌的药物敏感性PhaB可以检测每毫升少于100条菌的菌量，其敏感性可与PCR法相媲美，而且与培养法符合率高噬菌体生物扩增法,快杀菌药物如利福平、链霉素、喹诺酮类2天内可得药敏结果，与培养符合率超过95%；慢杀菌药物需要增加一个孵育过程使药物的杀菌效果能充分体现，所需时间约为3～4天，与培养符合率约90%左右五、荧光素酶法（Luciferase）,原理：含有荧光素酶编码基因的分枝杆菌噬菌体在分枝杆菌体内繁殖，并产生荧光素酶，加入荧光素底物后，在三磷腺苷（ATP）存在的情况下，就会产生荧光，这种荧光可被对磷酸敏感的膜或荧光计检测到。
如果在繁殖物中加入抗结核药物后荧光消失，此菌则对药物敏感，反之则为耐药 方法特点：可以在几个小时内迅速检测利福平、链霉素对TB的作用，对异烟肼、乙胺丁醇的检测需要2～3天检测可于96孔板上进行，并且可以自动化，因而能快速进行大批量的样本检测六、流式细胞计数法,原理：乙酰乙酸荧光素（FDA）能穿透活的分枝杆菌疏水细胞膜，并很快被内源性酯酶水解成游离荧光素，由于荧光素在菌体内堆集使之易被流式细胞仪测定，而死菌或被抗结核药物抑制的分枝杆菌不能水解或仅能水解少量FDA，故荧光素含量很低，不能被流式细胞测定根据所检测到的荧光强度的变化来判断细菌经抗生素处理后的细菌存活状态，进而推断MIC该方法24小时内即可获得结果，且与传统的药敏试验方法完全相符谢 谢 ！,。