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1、医院感染卫生学监测操作规程1. 医疗器械灭菌效果监测1.1 采样时间：在灭菌处理后，存放有效期内采样。1.2 无菌检验(无菌检验是指检查经灭菌的敷料、缝线、一次性使用的医疗用品、无菌器械以及适合于无菌间查的其它品种是否无菌的一种方法。).无菌检验应在洁净度为100级单向流空气区域内进行，应严格遵守无菌操作，避免微生物污染；对单向流空气区域及工作台面，必须进行洁净度验证。1.3 无菌检验前准备1.3.1 洗脱液与培养基无菌性试验：无菌试验前3d，于需-厌氧培养基与霉菌培养基内各接种1ml洗脱液，分别置30-35与20-25培养72h，应无菌生长。1.3.2阳性对照管菌液制备：1.3.2.1 在试
2、验前一天取金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003的普通琼脂斜面新鲜培养物，接种1环至需-厌氧培养基内，在30-35培养16h-18h后，用0.9%无菌氧化钠溶液稀释至10cfu/ml-100cfu/ml；1.3.2.2取生孢梭菌CMCC（B）64941的需氧菌、厌氧菌培养基新鲜培养物1接种环种于相同培养基内，于30-35培养18h-24h后，用0.9%无菌氧化钠溶液稀释至10cfu/ml-100cfu/ml;1.3.2.3 取白色念珠菌CMCC（F）98001真菌琼脂培养 基斜面新鲜培养物1接种环于相同培养基内，于20-25培养24h后，用0.9%无菌氧化钠溶液稀释至10cfu/ml-100c
3、fu/ml。1.4 无菌操作：取缝合针、针头、刀片等小件医疗器械5件直接浸入6管需-厌氧培养管（其中一管作阳性对照）与4管霉菌培养管。培养基用量为15ml/管。1.4.1 取5付注射器，在5ml洗脱液中反复抽吸5次，洗下管内细菌，混合后接种需-厌氧菌培养管（共6管，其中1管作阳性对照）与霉菌培养管（共4管）。接种量：1ml注射器为0.5 ml，2ml注射器为1ml，5ml-10ml注射器为2ml，20ml-50ml注射器为5ml ，培养基用量：接种量为2ml以下为15ml/管，接种量5ml为40ml/管。1.4.2 手术钳、镊子等大件医疗器械取两件用沾有无菌洗脱液的棉拭子反复涂抹采样，将棉拭子
4、投入5ml无菌洗脱液中，将采样液混匀，接种于需-厌氧培养管（共6管，其中1管作阳性对照）与霉菌培养管（共4管）。接种量为1ml/管，培养基用量为15ml/管。1.5 培养：在待检样品的需-厌氧培养管中，接种预先准备的金黄色葡萄球菌阳性对照管液1：1000稀释1ml，将需-厌氧培养管以及阳性与阴性对照管于20-25培养7d，培养期间逐日检查是否有细菌生长，如加入供试品后培养基出现浑浊或沉淀，经培养后不能从外观上判断时，可取培养液转种入另一支相同的培养基中或斜面培养基上，培养48h-72h后，观察是否再现浑浊或在斜面上有无菌落生长，并在转种的同时，取培养液少量，涂片染色，用显微镜观察是否有菌生长。
5、1.6 结果判定：阳性对照在24h内应有菌生长，阴性对照在培养期间应无菌生长，如需-厌氧菌及霉菌培养管内均有澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长，判为灭菌合格；如需-厌氧菌及霉菌培养管中任何1管显浑浊并证实有菌生长，应从新取样，分别同法复试2次，除阳性对照外，其他各管均不得有菌生长，否则判为灭菌不合格。1.7 注意事项1.7.1 时间不得超过6h，若样品保存于0-4，则不得超过24h1.7.2 被采样本表面积30 m2，设4角及中央5点，4角的布点部位距墙壁1m处。 4.2.2 采样方法：将普通营养琼脂平板（直径为9cm）放在室内各采样点处，采样高度为距地面1.5m采样时将平板盖打开，扣放于平板
6、旁，暴露5min，盖好立即送检。4.3 检测方法：按照2.1.3要求进行。 平板暴露法结果计算公式： 细菌总数（cfu/cm3）=50000N/(AT) 式中A为平板面积(cm2) ； T为平板暴露时间(min)；N为平板菌落数(cfu)4.4 结果判定4.4.1 类区域:细菌总数10 cfu/cm3 (或0.2 cfu/平板),未检出金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌为消毒合格； 4.4.2 类区域: 细菌总数200 cfu/cm3 (或4 cfu/平板),未检出金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌为消毒合格； 4.4.3 类区域: 细菌总数500cfu/cm3 (或10 cfu/平板),未检出金黄色葡萄
7、球菌、溶血性链球菌为消毒合格。4.5 注意事项: 采样前，关好门，窗，在无人走动的情况下，静止10min进行采样。5. 消毒液的监测: (使用中消毒液染菌量测定)检测方法：倾注法：用无菌洗管吸取消毒液1.0ml，加入到9.0ml含相应中和剂的无菌生理盐水采样管中混匀，分别取0.5ml放入2支灭菌平皿内，加入已熔化的450C480C的营养琼脂15ml18ml,边倾注边摇匀,待琼脂凝固,一平板置200C培养7d,观察霉菌生长情况;另一个平板置360C10C培养72h,记数菌落数,同时按3.17.15的原则检测病菌. 消毒液染菌量(cfu/ml)=每个平板上的菌落数206. 内镜消毒效果的监测6.1
8、 采样时间:在消毒灭菌后,使用前进行采样. 6.2 采样方法:用沾有含相应中和剂的无菌生理盐水的棉拭子,在检内镜下从镜头至镜身反复涂擦，剪去手接触部位，将棉拭子投入到5ml含相应中和剂的生理盐水采样管中，立即送检。 6.3 检测方法6.3.1 细菌总数的检测：将采样管在混匀器上振荡20s或用力振打80次，用无菌洗管吸取1.0ml待检样品接种于灭菌平皿，每一样本接种2个平皿，内加入已溶化的4048 的营养琼脂15ml18ml,边倾注边摇匀,待琼脂凝固,置361温箱培养48h，计数菌落数。 6.3.2致病菌检测：将采样管在混匀器上振荡20s或用力振打80次，按3.17.15原则检测致病菌 。6.3
9、 结果判定：灭菌后内镜，未检出任何微生物为合格。消毒后的内镜，细菌总数20cfu/件，并未检出致病菌为合格。6.4 注意事项：采样面积同物品和环境表面效果进行采样。7. 致病菌的检测检测原则：致病菌的检测依据污染情况进行相应指标的检测。 7.1 金黄色葡萄球菌检测7.1.1 增菌，分离: 取采样液1ml，接种于5mlSCDLP液体培养基中，于360C10C增菌24h。取1白金耳上述增菌液，在血平板上划线分离，360C10C培养24 h。7.1.2 观查菌落特征：在血琼脂平板上菌落形态为金黄色，圆形凸起，表面光滑，周围有溶血圈。7.1.3 镜检：挑取典型菌落作染色镜检。镜下为革兰阳性。成葡萄状排
10、列的球菌。7.1.4 生化反应：取可疑菌落作触酶，葡萄糖发酵，血浆凝固酶，接种于甘露醇发酵，新生霉素敏感实验，均为阳性者极为金黄色葡萄球菌。7.1.5 甘露醇发酵试验：取上述可疑菌落接种于甘露醇培养基，于360C10C培养24h，发酵甘露醇产酸者为阳性。7.1.6 血浆凝固实验：玻片法：洁净玻片一端滴一滴灭菌生理盐水，另一端滴一滴血浆，用白金耳挑取菌落分别与生理盐水和血浆混匀，5min内观察有无固体颗粒状物，若血浆出现凝块，生理盐水均匀混浊为阳性，两者均混浊为阴性。试管法：吸取1：4新鲜血浆0.5ml，放在灭菌小试管中，再加入等量待检菌24 h肉汤培养物，混匀后放入360C10C孵箱中，同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌肉汤培养物作对照，每30s观察一次，6h内出现凝块者为阳性。7.2 乙型溶血性链球菌检测7.2.1 增菌，分离：取样品1ml，接种于1葡萄糖肉汤，370C增菌24h。取1白金耳增菌液在血平板上作划线分离，360C10C培养24 h7.2.2 观查菌落特征：菌落形态为灰白色，半透明或不透明，针尖状突起，表面光滑，边缘整齐，周围有溶血圈。7.2.3 镜检：挑取典型菌落作染色镜检。镜下为革兰阳性。成链球状排列的球菌。7.2.4 生化反应：取可疑菌落作如下生化实验，如触酶阴性，链激酶试验阳性，对杆菌肽
