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1、毕业论文羊附红细胞体特异性抗原制备技术研究The Study on Preparation of Specific E.ovis Antigen学 生： 指导教师： 院 系：河北北方学院动物科技学院专 业：动植物检疫班 级：07级本科动检班论文提交日期：2011年6月9日目录1材料41.1实验动物41.2 主要试剂41.3 主要仪器42方法42.1应用药物体外驱虫法粗制羊附红细胞体抗原42.2 羊附红细胞体特异性抗原制备72.2.1 羊附红细胞体抗原蛋白悬液72.2.2 兔抗羊附红细胞体阳性血清的制备72.2.3 兔阴性血清的制备72.2.4 羊附红细胞体抗原全蛋白的SDS-PAGE试验72.
2、2.5 主要抗原蛋白的切胶纯化82.2.6 纯化抗原蛋白的SDS-PAGE试验82.2.7 纯化抗原蛋白的免疫印迹试验及特异性抗原蛋白的筛选82.2.8 羊附红细胞体特异性抗原的制备103 研究结果与分析103.1 解离液蛋白浓度测定103.2 羊附红细胞体特异性抗原制备结果103.2.1兔抗羊附红细胞体阳性血清效价测定结果103.2.2 羊附红细胞体抗原全蛋白的SDS-PAGE分析结果103.2.3 纯化抗原蛋白SDS-PAGE分析结果114 讨论125 结论14参考文献：15致 谢16 羊附红细胞体特异性抗原制备技术研究 摘要：为了提高羊附红细胞体(Eperythrozoon ovis)血
3、清学诊断的特异性和敏感性，本研究探索一种准确高效的羊附红细胞体特异性抗原制备技术。采集红细胞感染率90%的羊附红细胞体阳性抗凝血，应用药物体外驱虫法（每200mL血液依次加入双向红莲灭1mL）对羊附红细胞体进行解离，制备羊附红细胞体悬液。经过超声波裂解，制备附红细胞体抗原全蛋白悬液。应用羊附红细胞体抗原蛋白裂解液免疫家兔，制备兔抗羊附红细胞体阳性血清。将所制的的抗原蛋白进行SDS-PAGE试验，观察羊附红细胞体全抗原蛋白组分，选择4条染色较深的抗原蛋白进行切胶纯化，应用SDS-PAGE检验纯化结果，再应用免疫印迹技术（Western-blotting）确定有免疫原性的抗原蛋白成分。利用切胶纯化
4、技术收集有免疫原性的抗原蛋白成分。结果表明，羊附红细胞体抗原全蛋白经SDS-PAGE试验后，有4条抗原蛋白带显色较深。应用切胶技术分离此4条蛋白条带（条带1、条带2、条带3和条带4），经分析分子量分别为115.35kDa（道尔顿），74.13 kDa，68.87 kDa，32.96 kDa，免疫印迹试验表明，条带1、2、3为阳性，且条带2中只有部分成分与抗体反应，而条带4为阴性。因此，确定分子量为115.35kDa和68.87 kDa两条蛋白带为羊附红细胞体特异性抗原蛋白。 关键词：羊附红细胞体；体外驱虫；特异性抗原；切胶纯化The Study on Preparation of Specif
5、ic E.ovis Antigen Abstract：To improve specificity and sensitivity of serum diagnostic method to sheep Eperythrozoonosis, an accurate, efficient and specific antigen preparation technology was explored in the study.The positive anticoagulant blood (erythrocyte infection rate 90%) for Eperythrozoon ov
6、is was collected, and Eperythrozoon suspension was prepared using deworming methed in vitro.Eperythrozoon suspension was broke and cracked using the thawing - ultrasonic lysis method to prepare crude antigen solution. The crude antigen solution was used to immunize rabbits to prepare rabbit anti-she
7、ep Eperythrozoon positive serum. The prepared antigen protein was adopted for SDS-PAGE experiment, the whole Eperythrozoon wenyoni antigen protein component was observed. Four deeper staining antigen proteins were selected to cut out from gel and purify. The pure rusult was tested through SDS-PAGE.T
8、hrough the transfer electrophoresis and immune staining, the color of imaging protein band in nitrocellulose membrane can confirm whether these antigen proteins have the immunogenicity and the antigen proteins with immunogenicity were collected.The results showed the four protein bands of the Eperyt
9、hrozoon ovis entire antigen protein were stained deeply , Molecular weight of four separated protein bands (band 1, band 2, band 3 and band 4) using cutting gel technology was 115.35kDa，74.13 kDa，68.87 kDa，32.96 kDa，respectively. Western blot test showed that band 1, 2 and 3 were positive, and part
10、ingredient in band 2 responsed with antibody. The band 4 was negative.So the protein bands whose Molecular weight was 115.35kDa and 68.87 kDa were identified as specific antigen protein of Eperythrozoon ovis.Keywords: Eperythrozoon ovis; deworming methed in vitro; Specific antigen; Gel purified引言羊附红
11、细胞体病是由羊附红细胞体(E. ovis)寄生于羊的红细胞表面及血浆中所引起的一种烈性传染病，以发热、黄疸、溶血性贫血为主要症状，也可能和其它疾病混合感染，表现不同交叉症状。急性感染的羊临床症状典型，严重病例出现溶血性贫血，造成死亡，给养羊业造成巨大的经济损失。目前，诊断该病常用的镜检法准确性较差，血清学诊断因提取抗原的纯度较低，其特异性和灵敏性受到了影响，因此确诊该病有一定困难，在临床上往往因此而延误治疗时机，因此已经引起动物医学界的高度重视。探索快速准确的诊断方法是控制该病的有效途径，而获得高纯度抗原是关键。1986年， Lang首次从绵羊红细胞上分离出附红细胞体，1988年，Hall对L
12、ang的方法进行了改进，建立了分离附红细胞体的方法，推进了附红细胞体病血清学诊断和分子生物学研究的进程1。目前该方法仍被广泛应用，但存在收率低、纯度差等不足之处。在制备过程中，采血、洗涤红细胞以及摇床振摇等操作都可能造成红细胞溶血，导致所制备的抗原纯度降低，这必然影响血清学检测的准确性和特异性。针对这一问题，许多学者正在努力探索附红细胞体解离的方法，以求获得高纯度抗原。贾立军等于2004年比较了水浴法和化学试剂法解离猪附红细胞体效果，结果显示水浴法优于化学试剂法， 于2005年将两种方法用于解离牛附红细胞体，结果化学试剂法比水浴法好2,3。也有应用低渗法、皂素法和冻融法裂解红细胞，然后收集附红
13、细胞体的方法，但这些方法获取的抗原纯度均不是很高，收率低，并且工作量和难度都比较大。本研究在前人研究的基础上，应用药物体外驱虫法，从被感染羊血样中分离附红细胞体抗原，应用切胶纯化技术、SDS-PAGE和免疫印迹技术分析粗制羊附红细胞体的抗原成分，探究并提取有良好抗原性的蛋白成分，并制备特异性抗原，为建立特异、灵敏的血清学诊断方法奠定基础。1材料1.1实验动物 健康雄性家兔，体重2.02.5Kg，由张家口市某种兔场提供；小尾寒羊，选自张家口市某养殖场。1.2 主要试剂双向红链灭（又名复方三氮脒注射液，江西省百思特动物药业有限公司生产。规格 10ml：三氮脒0.2g ，多西环素0.2g）、酶标羊抗
14、兔IgG HRP、牛血清白蛋白（BSA）、低分子量标准蛋白质、辣根过氧化物酶（HRP）、Taq DNA 聚合酶、EcoR I核酸内切酶、dNTP Mixture、DNA Marker(DL2000)、蛋白酶K。 1.3 主要仪器单条可拆卸酶标板、DYCZ-24D双垂直电泳槽、YYCP-31DN水平电泳槽、DYCZ-40D型转印槽、Anke TGL-20B低速离心机、高速台式冷冻离心机（Anke TGL-16G-A）、WDP型微生物多用培养箱、 紫外可见分光光度计UV755B、 MULTISKAN MK3酶标定量测定仪（Thermo）、JY88-2超声波细胞粉碎机、DYY-10C型电泳仪、WD-
15、9413B凝胶成像分析仪、PCR扩增仪。 2方法2.1应用药物体外驱虫法粗制羊附红细胞体抗原2.1.1采集血样 无菌颈静脉采集羊血液，3.8%柠檬酸钠抗凝，镜检，发现红细胞感染率大于90%，符合试验要求。2.1.2 羊附红细胞体解离 血液经2000r/min离心10min，去除血浆、白细胞及血小板，用生理盐水洗涤红细胞3次，加入生理盐水复原体积，于200ml血液加双向红链灭1.0mL，4作用36h，使附红细胞体游离红细胞。将药物体外驱虫法解离后的血液3000 r/min离心15min，取上清液。将所得的上清液12000r/min离心40min，沉淀即为附红细胞体抗原，加适量生理盐水。2.1.3 制备羊附红细胞体抗原全蛋白悬液 将制备的附红细胞体抗原进行超声波裂解（功率60w，裂解时间10min），即得羊附红细胞体抗原全蛋白悬液。2.1.4 测定蛋白质浓度：取50L附红细胞体抗原全蛋白悬液，加2950L生理盐
