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1、乙肝病毒YMDD变异的检测,乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus, HBV),P区最长，约占基因组75%以上，编码病毒体DNA多聚酶。,HBV DNA负链有四个开放区，分别称为S、C、P及X,HBV属于嗜肝DNA病毒科。其基因组大小 仅约3200 bp，是已知真核细胞病毒中最小的DNA 病毒。,乙型肝炎流行病学,何为YMDD变异,HBV P区编码的DNA聚合酶基因在739或741位点发生突变，其编码的HBV逆转录酶活性部位“酪氨酸（Y）蛋氨酸（M）天门冬氨酸（D）天门冬氨酸（D）”(YMDD主型区)，变为“酪氨酸（Y）缬氨酸（V）天门冬氨酸（D）天门冬氨酸（D）”（YVDD）或“
2、酪氨酸（Y）异亮氨酸（I）天门冬氨酸（D）天门冬氨酸（D）”（YVDD）导致逆转录酶亚结构发生改变，妨碍了与拉米夫定的结合，从而造成HBV对拉米夫定敏感性下降。,YMDD突变,Met-ATG YMDD Val-GTG YVDD Ile-ATT ATC YIDD ATA,Lamivudine and wild-type HBV,HBV polymerase,Nucleotides,Lamivudine and YMDD variant HBV,Nucleotides,ss (-) DNA,HBV polymerase,(variant),Y,V/I,D,D,reduced affinity,La
3、mivudine,weak inhibition,YMDD变异的发生,病 毒,病毒多聚酶 缺乏矫正功能,Lamifudin 作为选择因素,对耐药突变株的选择,病毒高复制 高变异率,Lamifudine停药后,YMDD野生株恢复,拉米夫定治疗HBV感染 治疗过程与YMDD变异关系,引自J Virol. Metods 1999；83：181-187,对拉米夫定耐药株的防治,针对病毒 阿地福韦 拉米夫定+阿地福韦 拉米夫定+干扰素 (或IFN续贯治疗),针对宿主 细胞因子 HBV DNA疫苗 诱导持续病毒抑制 恢复特异性抗HBV CD4/CD8免疫应答,1Gish RG, Antimicrob Ag
4、ents Chemother, 2002;46:1734-1740 2Santantonio T, J Hepatol, 2002;36:799-804,Lamifudine抗HBV治疗过程中需注意的 病毒变异问题,Lamifudine对HBV YMDD野生型的抗病毒作用优于Adefovir，而且对机体潜在副作用也小于Adefovir，所以针对携带HBV YMDD野生型患者，首选择Lamifudine。 在Lamifudine治疗过程中动态监测YMDD变异情况，一旦出现YMDD变异，改用Adefovir，这样可以持续抑制病毒变异株，第一时间就使病毒变异株就处在抑制状态。 在使用Adefovir
5、药物治疗过程，也动态检测YMDD变异情况，防止YMDD野生株回复成优势株，一旦出现YMDD野生株成为优势株，改用Lamifudine或者联合Lamifudine和Adefovir抗HBV治疗是可取的。通过对YMDD变异的动态监测，有助于合理选择药物，长期使HBV处于低水平复制状态，甚至耗竭HBV cccDNA库，达到彻底消除HBV的目的。,病毒耐药性的诊断,表型耐药在治疗期间血清病毒DNA水平上升 基因型耐药病毒多聚酶基因出现突变,1Nafa S, Hepatology,2000;32:1078-1088 2Stuyver L, J clin Microbiol,2000;38;702-707
6、,YMDD突变检测常见方法,基因测序法 ELISA法 生物芯片 荧光定量PCR方法,基因测序法,这是一种比较经典的方法，突变检测的准确性为100，但测序周期较长，仪器昂贵，不适于临床大面积推广,ELISA法和PCR-RFLP法,操作繁琐，费时，不适合当天出检测报告 在进行PCR扩增后进行开放性实验，容易造成标本的交叉污染，影响实验室的质量控制,生物芯片,需要配置芯片仪，一次性投入资金较大， 且芯片成本较高，不适于在临床大面积推广 需要开放式杂交，会造成一定的交叉污染，影响结果,Taqman荧光定量PCR原理,特异性荧光双标记探针 Taq酶 53外切酶活性,延伸,结束,检测荧光,变性,退火,试剂原理,野生型,变异型,Thank you!,
