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1、病毒感染的实验诊断第一节概述一、病毒的基本性状病毒是一类非细胞型微生物，个体极小，可通过细菌滤器，需用电子显微镜观察。仅含一种核酸作为遗传物质，外被蛋白质衣壳或还有包膜。病毒只能在活细胞内寄生，以复制的方式进行增殖。在临床微生物感染中，近75%的传染病是由病毒引起的。（一）形态结构1.大小和形状 病毒体极其微小，测其大小的单位用纳米表示。根据其大小大致分为：大型病毒（200300nm）、中型病毒（80160nm）和小型病毒（1830nm）。病毒的形态大致可分为：球形或近似球形、杆状、子弹状、砖形、蝌蚪状等。2.基本结构 是指病毒的核心和衣壳两部分。病毒的核心充满一种类型的核酸，即DNA或RNA
2、，构成病毒的基因组。此外，核心还含有少数功能蛋白，主要是病毒早期复制所需的一些酶。病毒的衣壳是包围在核酸外的一层蛋白质，由一定数量的壳粒聚合而成。衣壳可保护核酸免受核酸酶及其他理化因素的破坏。3.辅助结构 病毒的包膜是病毒成熟后以出芽方式释放包围在核衣壳外的宿主细胞成分。包膜嵌有病毒编码的糖蛋白，具有病毒的特异性。无包膜的病毒衣壳上也有些突出物。（二）病毒的增殖 病毒必须依赖宿主细胞，以特殊的自我复制方式进行增殖。病毒的复制周期一般可分为吸附、穿入、脱壳、生物合成、组装与成熟、释放6个阶段。若病毒进入细胞后的环境不利于它的复制，不能组装或释放有感染性的病毒颗粒，称为顿挫感染。由于病毒基因组不完
3、整或基因位点改变而复制出不完整无感染性的病毒，称为缺损病毒。当两种不同的病毒或两株性质不同的同种病毒，同时或先后感染同一细胞或机体时，可发生一种病毒抑制另一种病毒增殖的现象，称为病毒的干扰现象。干扰现象是机体非特异性免疫的一部分，是抗病毒免疫的重要内容。除干扰现象外，当一个细胞受到两种或两种以上的病毒感染时，还可出现双重感染、互补、加强、表型混合与病毒杂交等现象。（三）病毒的遗传和变异 病毒在增殖过程中常发生基因组碱基序列的置换、缺失或插入，引起基因突变。病毒因基因突变而发生表型改变的毒株称为突变株。1.基因突变 条件致死性突变株、宿主范围突变株、耐药突变株。2.基因重组与重配3.基因整合 某
4、些病毒感染宿主细胞的过程中，病毒的DNA片段可插入细胞染色体DNA中，这种病毒基因组与细胞基因组的重组过程称为基因整合。（四）噬菌体 除了以动、植物细胞为宿主的病毒外，尚有以细菌、真菌等为宿主的病毒，这些侵袭细菌等并在其中增殖，能引起细菌等裂解的病毒称噬菌体。噬菌体具有识别细菌表面特异受体的功能，这种特异性是极为严格的，可用于进行细菌的鉴定与分型。噬菌体感染细菌后产生两种后果：一是噬菌体增殖并裂解细菌，建立溶菌周期；二是噬菌体在细菌内不增殖，其核酸整合于细菌染色体内，并可随细菌分裂而将噬菌体的核酸传至子代细菌中，建立溶原状态。（五）非寻常病毒 非寻常病毒是比病毒更小更简单的致病因子，又称为亚病
5、毒因子，包括类病毒、卫星病毒和朊粒等。朊粒个体微小，不含核酸，其主要成分是一种蛋白酶抗性蛋白，对各种理化作用的抵抗力强，具有传染性，是引起传染性海绵状脑病的病原体。朊粒至中枢神经系统退化性病变，引起牛海绵状脑病，俗称疯牛病。人类的克雅病（CJD）和Kuru病被认为与朊粒感染有关。二、病毒的分类与命名病毒分类的依据和原则是病毒的基本性质，主要包括病毒的大小与形态；核衣壳的对称类型；有无包膜及刺突；病毒基因组的特征；天然宿主范围；传播方式、媒介种类以及致病性、组织嗜性和病理学特性。病毒分类的一般系统是科、属、种3级或科、亚科、属、种4级。1995年的分类报告首先将病毒分为DNA病毒、RNA病毒、D
6、NA和RNA反转录病毒三大类。目前认为有24个科的病毒能感染人类和动物。按传播途径可分为呼吸道病毒、胃肠炎病毒、经性传播感染的病毒等。按感染部位与症状特征可分为肝炎病毒、出血性热病毒、疱疹病毒等。第二节病毒感染的实验诊断病毒可侵犯人体各系统，所致疾病见于临床各科，临床表现复杂多样。病毒学研究发展较快，免疫学和分子生物学技术的迅速发展，出现了不少快速、简便、敏感、高特异性的实验室诊断方法。病毒学实验室诊断有三个方面：直接检测和分离鉴定；检测病毒蛋白抗原成分和核酸；检测抗体。一、标本采集、运送及处理（一）标本采集1.采样时机应在患者急性期或发病初期采集标本。2.标本种类根据不同病毒感染采集不同标本
7、，如鼻咽分泌物、脑脊液、血液、粪便等。（二）标本的运送及保存 大多数病毒抵抗力较弱，在室温中易被灭活，所以标本要快速传递，立即处理和接种。采集和运送过程注意冷藏。如不能立即处理和接种，可在4保存数小时，长时间保存需置-70。对于在冻融过程中易失去感染性的标本，冻存时应加入适当的保护剂如甘油或二甲基亚砜等。（三）标本处理 根据不同种类的标本，运用不同的处理方法。凝固的血液需先离心，得到的血清可以用于病毒分离。肝素抗凝全血、脑脊液、胸腔液、水痘液以及尿液均可直接用于病毒分离培养。有些标本如粪便等，常需粗提、提纯和浓缩等复杂处理过程。二、分离培养与鉴定（一）分离培养1.组织培养 包括器官培养、组织块
8、培养和细胞培养。前两者只是在分离某些特殊病毒时需要，目前常用的方法是细胞培养。关键是针对不同的欲检测病毒，选择适当的培养细胞。细胞培养根据细胞的来源、染色特征及传代次数主要分3种类型：原代和次代细胞培养；二倍体细胞株；传代细胞系。2.鸡胚接种 鸡胚常用于黏液病毒、疱疹病毒、痘类病毒等的原代分离。根据病毒种类的不同，接种鸡胚的部位也各异。如乙型脑炎病毒以接种卵黄囊为最佳，羊膜腔和尿囊腔适合于流感病毒和腮腺炎病毒，绒毛尿囊膜对痘类病毒和疱疹病毒形成痘疮非常敏感。3.动物接种 实验室常用新生小鼠或乳鼠进行病毒分离。根据病毒种类不同，需选择相应的敏感动物，还需接种相应的合适部位（鼻内、皮内、皮下、脑内
9、、腹腔内、静脉等）。如嗜神经病毒（流行性乙型脑炎病毒），最好接种小鼠脑内。（二）病毒鉴定1.初步鉴定 根据临床症状、流行病学特点、标本来源、易感动物范围、细胞病变特征及生物学特征、理化性质可初步判断病毒的科及属。如B组柯萨奇病毒仅对新生乳鼠有致病性，而对成年小鼠无致病性，腺病毒可使细胞肿胀，颗粒增多，病变细胞聚集成葡萄状。核酸类型测定可将DNA病毒与RNA病毒进行区分，耐酸试验可将肠道病毒与鼻病毒大致区分开。2.最终鉴定 在初步鉴定的基础上，选择适当的血清学方法对病毒分离株进行最后鉴定，方法是将分离到的病毒和已知病毒的参考血清学试验。血清学诊断方法很多，常用的有中和试验、补体结合试验、血凝抑制
10、试验、免疫荧光试验、酶免疫试验等。现在分子生物学方法也在病毒鉴定方面得到应用。三、快速诊断（一）显微镜检查1.用光学显微镜直接检查病毒包涵体。在普通光学显微镜下，胞质或胞核内的包涵体呈现嗜酸或嗜碱性染色，大小和数量不等。包涵体检查可作为病毒感染的辅助诊断，不是特异性试验。2.用电子显微镜直接检查病毒颗粒，数小时即可从病毒形态上作出明确的鉴别诊断。应用免疫电镜灵敏度更高。（二）病毒抗原检查 利用特异性免疫血清检测标本中的病毒抗原。常用方法有：免疫荧光技术、酶免疫技术等。此外还有放射免疫法、反相间接血凝和对流免疫电泳等方法。对于一些血清型别不多或在一般细胞培养系统中尚不能成功增殖的病毒，直接检测病
11、毒抗原是快速而实用的方法。（三）病毒抗体检查 利用特异性抗原检测病毒感染者血清中的IgM和IgG抗体。常用的方法有中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验及免疫扩散等，还可以利用放射免疫法及酶联免疫吸附法。IgM抗体出现在病毒感染的早期，所以标本采集时间对检测结果的影响很大。IgG抗体检测需采集感染急性期与恢复期双份血清，恢复期IgG效价必须比急性期增高4倍或4倍以上时，才有诊断意义。（四）病毒核酸检测 利用核酸杂交和PCR技术检测病毒特异基因片段。但检出病毒核酸并不等于检出具有传染性的病毒颗粒。第三节各类病毒感染的简介一、呼吸道病毒（一）流行性感冒病毒1.生物学性状（1）形态与结构：流感病毒属正
12、黏病毒科。病毒颗粒具有多形性，一般为球形或丝状，丝状多见于新分离株，感染性较强。其结构由内至外为。1）核心：位于病毒最内层，是由核酸和核蛋白组成，流感病毒的核酸为分节段的单负股RNA，节段间易发生基因重组，从而引起变异；核蛋白为型特异性抗原，抗原性稳定，很少发生变异。2）基质蛋白（M蛋白）：位于包膜与核心之间具有保护核心与维持病毒外形的作用。其抗原性稳定，具有型特异性。3）包膜：位于M蛋白外面的脂质双层，含有宿主细胞膜成分，其中镶嵌有突出于病毒表面的两种结构蛋白，一种为血凝素（HA），另一种为神经氨酸酶（NA）。其抗原性是划分流感病毒亚型的依据。（2）分型与变异1）分型：根据核蛋白抗原和M蛋白
13、的不同，将流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）型，甲型流感病毒根据NA和HA的抗原性不同又分为若干亚型。2）变异：流感病毒易发生变异，变异的物质基础是HA和NA，两者变异可同时出现，也可单独出现。抗原变异幅度小时称为抗原漂移，如果变异幅度大形成新的亚型，一般引起大规模流行，这称为抗原转变。（3）培养特性：流感病毒常用鸡胚接种培养，初次分离接种羊膜腔为最佳，传代适应后可移种尿囊腔。细胞培养一般用原代猴肾细胞（PMK）或犬肾传代细胞（MDCK）。利用红细胞凝集试验确定病毒的存在。（4）抵抗力：不耐热，对干燥、日光、紫外线以及甲醛、乙醇等均敏感。2.微生物检验（1）标本采集和处理：在发病急性期，
14、以前3天为最好。合理采集相应标本，如鼻腔洗液、咽拭子、鼻拭子等，置于Hanks液中。采集的标本应立即放入冰壶中，速送实验室。若48小时内未能进行接种，标本应放于低温中保存。（2）分离培养与鉴定：标本置于Hanks液中加抗生素处理，将处理的标本接种于鸡胚羊膜腔，353天后，收集羊水和尿囊液进行血凝试验并测定滴度。血凝阳性者，用已知抗体作血凝抑制试验进行鉴定。若血凝阴性时，需用鸡胚盲传12次，仍不出现血凝阳性者，方可判断病毒分离阴性。也可接种原代猴肾细胞（PMK）或犬肾传代细胞（MDCK）进行培养。（3）快速诊断1）免疫荧光技术和酶免疫技术。2）分子杂交技术。3）PCR技术。4）免疫电镜技术。（4
15、）血清学诊断：需同时检测急性期（5天以内）和恢复期（24周）血清，在相同条件下进行血凝抑制试验，如恢复期抗体效价比急性期髙4倍或4倍以上即有诊断意义。3.临床意义 流感病毒是在呼吸道柱状上皮细胞内复制，病毒随飞沫传播进入易感者呼吸道，依靠血凝素与黏膜柱状上皮细胞相应受体结合，感染细胞。主要在呼吸道增殖，很少入血，但代谢毒素样物质可进入血流引起发热、头痛和全身酸痛。甲型流感可以是散发，也可以是全球性大流行。乙型流感的播散速度及范围不如甲型。1997年在香港确诊有人感染H5N1禽流感病毒。（二）副流感病毒1.生物学性状 属副黏病毒科、副黏病毒亚科、副黏病毒属。形态结构类似流感病毒，但体积较大，其核酸为单负股RNA，不分节段。包膜上嵌有两种糖蛋白刺突，一种为HN（hemagglutinin neuraminidase），具有血凝和神经氨酸酶活性。具有流感病毒HA的吸附作用，另一种为F（fusion）具有使病毒进入宿主细胞和使病毒在宿主细胞之间传播的作用。副流感病毒抵抗力弱，不耐酸，对热敏感。2.微生物检验（1）标本采集
