课件：生物制药技术三

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1、第三章 细胞工程制药,细胞工程(cell engineering)是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，并通过细胞融合、 核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。,1665年英国物理学家胡克用自制的显微镜发现了细胞.,胡克所用的显微镜及观察的栎树细胞壁,1674年荷兰科学家列文虎克才真正观察到了细胞,细胞是一切生命活动的基本结构和功能单位。,第一节 细胞融合,细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂交（somatichybridiazation），是

2、指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。,一、细胞融合的定义,广义：,细胞融合是指用人工方法使两种或两种以上的体细胞合并形成一个细 胞，不经过有性生殖过程而得到杂种细胞的方法。,狭义：,Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。 Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。 Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(18

3、80)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。 1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 20世纪80年代出现了电融合技术。,二、细胞融合研究进展,几种细胞融合成功的例子,植物融合细胞成长状态对比,右瓶为地面融合的细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞,动物细胞融合实验使用的小白鼠,三、细胞融合的意义,理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的

4、开发和利用具有深远的意义。 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离 机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，从而产生新的核外遗传系统。,四、细胞融合的方法,诱导细胞融合的方法有3种:生物方法(常用仙台病毒) 化学方法(常用聚乙二醇) 物理方法 (电激和激光),1、仙台病毒法, 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近； 通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透； 两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体； 进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。,仙台病毒诱导细胞融合经四个阶

5、段：,病毒促使细胞融合的主要步骤如下：, 两种细胞在一起培养，加入病毒，在4条件下病毒附着在细胞膜上。并使两细胞相互凝聚； 在37中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2； 细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP； 融合成巨大细胞，仍需ATP 。,用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图,聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作细胞融合剂。 PEG浓度以W/W；如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合（假定1ml 培养液为1g重)，即成50PEG溶液。

6、 PEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。 通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好，50PEG溶液能产生 最多杂交细胞。 PEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。,2、聚乙二醇（PEG）法,聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程,PEG的作用机理： 由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。,PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其

7、缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。,聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤 （1）将两种不同亲本细胞各5l06混匀； （2）离心沉淀，吸去上清液； （3）加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟； （4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液； （5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养 液至 5ml，37的CO2培养箱中培养。 （6）624小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。,3、电融合法,电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成

8、完整的膜，形成融合体。 电融合法的优点： 融合率高、重复性强、对细胞伤害小； 装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程； 免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。,电融合的基本过程： 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串； 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。,电融合诱导法原理示意图,五、影响细胞融合的因素,1、亲本细胞表面性质 2、亲本细胞种类 3、细胞融合时的温度

9、和运动状态 4、通氧状态 5、PEG 6、离子浓度及种类 7、PH值,六、细胞融合的基本操作过程, 制备原生质体 由于微生物及植物细胞具有坚硬的细胞壁，因此通常需用酶将其壁降解。动物细胞则无此障碍。 诱导细胞融合 两亲本细胞(原生质体)的悬浮液调至一定细胞密度，按适当比例混合后，逐渐滴人高浓度的聚乙二醇(PEC)等诱导融合，或用电激的方法促进融合。 筛选杂合细胞 将上述混合液移到特定的筛选培养基上，让目的杂合细胞生长，其他细胞无法生长。藉此获得具有双亲遗传特性的杂合细胞。,植物细胞融合过程,人造小鼠培育过程示意图,七、 杂种细胞的筛选,根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其分为以下几种

10、类型： 异核细胞：非同源细胞的融合体。 同核细胞：两个相同细胞的融合体。 多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体。,常用的杂种细胞筛选方法：,基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选 基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选 由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选 具有所需性状杂种细胞的筛选,第二节 动物细胞培养技术及其应用,一、通过动物细胞培养可生产的生物制品,1、病毒疫苗 2、非抗体免疫调节剂 3、多肽生长因子,4、激素 5、酶 6、病毒杀虫剂 7、肿瘤特异性抗原,8、单克隆抗体 9、细胞本身,二、 动物细胞的形态和生理特点,1、动物细胞的形态,动物细胞属于真核细胞，结构复杂，分化精确，不同细

11、胞执行不同的功能，具有不同的形态。,但细胞在离体培养时形态会发生变化，根据不同的需要将离体培养的细胞分为： 贴壁细胞、悬浮细胞和兼性贴壁细胞 。,（1）、贴壁细胞（anchoraged-dependent cell ） 生长时必须要有给以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长和繁殖。 大多数动物细胞都属于此类。,贴壁细胞在表面上生长时有两种形态: 成纤维样细胞型和上皮样细胞型。,（2）、非贴壁细胞（anchoraged-independent cell ） 生长不依赖支持物表面，在培养液中悬浮生长。 如：血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和某些转 化细胞，Nama

12、lwa细胞。,（3）兼性贴壁细胞 对支持物的依赖性不严格，既可贴壁生长， 也可悬浮生长。 如：CHO细胞、BHK细胞、L929细胞。 理想的药物生产细胞系,2、动物细胞生理特点,（1）分裂期长 ，细胞生长缓慢，易受微生物污 染，培养时需要抗生素。,（2）细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。,（6）动物细胞蛋白质的合成在内质网上进行， 多数为糖蛋白，需要糖基化。,（3）正常二倍体细胞的寿命是有限的，正常二倍体细胞传代培养都是有限的。,（4）动物细胞对周围环境十分敏感。,（5）动物细胞对培养基要求很高。,动物细胞能精确地转译和加工较大或更复杂的克隆蛋白质;多半可分泌到细胞外，提取纯化方便;蛋白

13、质经糖基化修饰后与天然产物更一致，适合于临床应用。,动物细胞作为宿主细胞生产药物优点：,缺点：,培养条件要求高、成本高、产量低。,三、生产用动物细胞的获得,直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化后获得的细胞悬液。,1、原代细胞,原代细胞经过传代、筛选和克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。,2、二倍体细胞,通过转化形成，变成了异倍体，有无限增殖能力。转化可自发，在传代过程中自己转变成可无限增殖的细胞；也可人为转化，采用某些试剂处理，或从动物的肿瘤组织中建立的细胞系。,3、转化细胞系,常用的生产用动物细胞：,WI-38：人二倍体细胞系，成纤维细胞，能产生胶原， 倍

14、增时间为24小时，有限寿命50代，用于制 备疫苗。 MRC-5：人二倍体细胞系，成纤维细胞，有限寿命42- 46代，用于制备疫苗。 CHO-K1：从中国仓鼠卵巢中分离的上皮样细胞，用于 构建工程菌。 BHK-21：从仓鼠幼鼠的肾脏中分离。成纤维样细胞， 用于构建工程菌，可生产疫苗。 Vero： 从非洲绿猴肾中分离，贴壁依赖的成纤维细 胞，用于制备疫苗。 Namalwa：从淋巴瘤病人分离，生产干扰素。 SP2/0-Ag14：从抗羊红细胞活性的小鼠脾细胞和骨髓 瘤细胞系融合获得，生产单克隆抗体。,四、 动物细胞的培养条件和培养基,1、动物细胞在体外培养所需条件,（1）水质要求：培养时常采用经活性炭

15、、微滤、超滤、反渗透四级净化处理制得的达到国家标准的纯 净水。,（2）pH：影响细胞的存活力，生长及代谢，细胞生长的最适pH因细胞类型不同而异，范围为7.0-7.5。,（3）渗透压：在细胞培养的所有操作中，为了使与细胞接触的所有液体都保持较合适的渗透压 和pH,都必须采用等渗的溶液。,（4）温度：动物细胞对温度特别敏感，一般动物细胞特别是哺乳动物细胞的最佳培养温度为(37士0.5) 。,（5）溶氧：保证有适量的氧气供应。,（6）灭菌：所有的与细胞接触的设备、器材和溶液都必须保持绝对无菌，避免污染。,2、动物培养基的种类和组成,（1）、天然培养基：血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。,

16、（2）、合成培养基：组成稳定、可大量生产供应，成分为氨基酸、维生素、糖类、无机盐、小牛血清等。,（3）、无血清培养基：在天然或合成培养基的基础上添加激素、生长因子、结合蛋白、贴附和伸展因子及其他元素。,（1）提供激素及低分子量营养物。 （2）提供结合蛋白质，能识别维生素、脂类、 金属和其他激素等。 （3）有些情况下，结合蛋白能与有毒金属和热 原结合，起到解毒作用 （4）起酸碱度缓冲剂作用。 （5）提供蛋白酶抑制剂，使细胞传代时使用的 胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。,血清主要功能：,（1）在进行激素和药物研究时，血清成分与激素或药物结合的结果，干扰了其对细胞的作用。 （2）在进行细胞营养研究时，由于血清组成的复杂和不稳定，妨碍对细胞营养要求的确切了解。,血清对实验的负面影响：,（3）干扰对培养细胞释放产物的分析 （4）血清只能过滤消毒，过滤消毒只能除去细菌，但不能除去血清中可能含有的病毒和支原体。 （5）血清中可能有抑制病毒的因素，干扰病毒研究实验。,五、动物细胞大规模培养技术,1、动物细