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1、第十三章 血栓与止血检验,编辑制作 熊石龙,一、基本理论,血管壁的正常结构包括三层：内层、中层和外层 内层：内皮细胞+基底膜 内皮细胞管壁有肝素类物质 内皮细胞内含细胞器 （棒状小体 vWF和t-PA，TM，AT-,PAI-1等 ） 中层：平滑肌细胞（脉细血管无此层） 外层：结缔组织,血管壁的结构,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,激活血小板,激活凝血过程,抗血栓特性,收缩反应,血管壁的止血功能,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,一、基本理论,血小板的止血功能,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,血管损伤（抗血栓特性降低） 血管收缩 激活凝血过程 血流减慢 纤维蛋白形成
2、血管内皮下成分暴露 血小板黏附、聚集、释放 血栓形成,血浆血管性血友病因子抗原vWF:Ag，ELISA法,原理纯化的兔抗人vWF:Ag抗体包被聚苯乙烯反应板，加入稀释的待测血浆，样本中的vWF:Ag结合于固相的抗体上，然后加入酶标记兔抗人vWF:Ag抗体，与其定量结合，洗去多余抗体后，加底物显色，通过查找标准曲线，即可计算出vWF:Ag的含量。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,二、血管壁（内皮）检验,vWF:Ag 操作,单抗以0.1mol/L的碳酸盐缓冲液（pH9.5）稀释成10g/ml加入反应板中，每孔0.2ml，置于湿盒中4过夜。 0.05%Tween20，0.01mol/L磷酸
3、盐缓冲液（pH7.4，TweenPBS）洗3次后加入用0.4%BSAPBS稀释的待测血浆或培养液上清，每孔0.2ml，37温育2小时。 同前洗涤3次后，加入用同上缓冲液稀释的酶标vWF单抗，每孔0.2ml，37温育2小时。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,vWF:Ag 操作,同前洗涤5次后，每孔加底物溶液（OPD 1mg/ml，用0.1ml/L，pH4.5的枸橼酸盐缓冲液配制，30%过氧化氢0.5g/ml）0.2ml，置室温约5分钟后，各孔加3mol/L硫酸0.05ml终止反应。 室温放置10min后在酶标仪上测定492nm处的吸光度值。 绘制标准曲线 正常混合血浆以0.4%BSAP
4、BA按1：20、1：50、1：100、1：200、1：500、1：1000六种浓度稀释，与待测样品在相同条件下测定。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,参考值： 61.6%126.6% 注意事项 对血浆vWF：Ag浓度过高的标本，应稀释后再测定。 所有ELISA测定中应注意的事项均应引起重视。 除本方法外，也可以采用胶乳增强免疫比浊法。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,vWF:Ag 参考区间,vWF:Ag 应用评价,血管性血友病因子抗原测定主要用于血管性血友病的诊断和鉴别诊断 1.减低 见于血管性血友病（vWD），是诊断vWD及其分型的重要依据 2.升高 见于血栓性疾病，如急
5、性冠脉综合征（ASC）、心肌梗死、 脑血管病变、妊娠高血压综合征、肾小球疾病等，同时也见 于剧烈运动后，肾上腺素受体被兴奋等。 应用评价以前vWF：Ag定量常采用免疫火箭电泳，由于操作较为复杂，现在少用。ELISA常用于定量检测vWF：Ag，但是胶乳增强的免疫比浊法更为简便快速，而且可以在全自动血凝仪上进行测定。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,凝血酶调节蛋白，TM,原理将抗人凝血酶调节蛋白（Thrombomdulin,TM）单克隆抗体包被于聚苯乙烯放免小杯中，样本中的TM结合于包被的放免小杯上，加入125I-抗人TM单抗，根据结合的125I放射性强度计算出样品中TM的含量。,第十三
6、章 第一节 血管壁的止血作用及检验,TM 操作,1.绘制校正曲线 人TM标准品用缓冲液A做倍比稀释，TM的浓度分别为500，250，125，31.25，15.6，7.3,3.9和0ng/ml,以人TM浓度为横坐标，以cpm为纵坐标绘制校正曲线。 2.将200l的抗人TM单抗包被液加入聚苯乙烯放免小杯中，4过夜，用洗涤液A洗3次，将待测样本（或标准品）0.25ml与等量缓冲液A混合，每小杯加入20l稀释样品液（空白管加入缓冲液A），37水浴2h，用洗涤液A洗3次，加入200l125I-抗人TM单抗，37水浴2h，再用洗涤液B洗六次，在闪烁测定仪上测定放射活性，在校正曲线上查出相应的浓度。 TM
7、参考区间 2552g/L,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,TM是由血管内皮细胞合成和分泌释放的，它表达于血管内皮细胞表面，和循环血液中的凝血酶形成1：1的TM-凝血酶复合物，此复合物将蛋白C（PC）激活为活化蛋白C（APC），APC有灭活Fa、Fa和激活纤溶活性的作用，因此TM对于血管的抗凝作用十分重要。正常情况下，血浆中TM的含量很低，但当血管内皮受损后，血浆中的TM含量明显升高且与内皮的损伤程度相关。目前认为，TM:Ag的检测是了解血管内皮损伤最好的指标。 TM:Ag的水平升高 见于血栓性疾病，如糖尿病、心肌梗死、脑血栓、深静脉血栓形成（ DVT）、DIC等。,第十三章 第一节
8、血管壁的止血作用及检验,TM 应用评价,TM 注意事项,1.如果样品不能当天测定，应在采血后立即将血浆分离出放于-20冷冻保存。冷冻的样品复溶时应在37水浴中进行，室温中缓慢解冻则可导致TM沉淀。 2. 若样本中的TM含量超过校正曲线范围应适量稀释后再次测定。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,血浆6-酮-前列腺素F1检测,原理 ELISA法：将抗原（血浆6-酮-前列腺素F1-牛血清白蛋白连接物）包被于固相载体上，与游离抗原（待测样品或6-酮-前列腺素F1标准品）竞争性地与一定量的抗6-酮-PGF1抗体结合，洗涤后加入过量的酶标记第二抗体，再加入底物显色。待检血浆或标准品中的6-酮-P
9、GF1含量与显色程度呈负相关，根据显色程度（A值）即可从标准曲线中推算出待检血浆中6-酮-PGF1的含量。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,血浆6-酮-前列腺素F1检测 操作步骤,1.标本采集 顺利采取静脉血后与5%EDTA-Na2进行9：1抗凝混匀，3000r/min离心20min分离出血浆。 2.用碳酸盐缓冲液将6-酮-PGF1-BSA作一定稀释后包被于酶标反应板，再用0.3%明胶封闭。加入标准品（倍比稀释成12.51600pg/ml 浓度）或待测样品、兔抗6酮-PGF1IgG100l后在37中温育2h。洗涤后再加入酶标第二抗体200l在37反应2h。以OPD-过氧化氢为基质显色
10、20min，加入3mol/L硫酸中止反应，在酶标检测仪上测定490nm处的吸光度值A。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,血浆6-酮-前列腺素F1检测 参考区间,标准曲线与计算 式中:B为测定管；B0为不加样品管，最大结合率管；B/B0为结合率。 以标准品含量为横坐标，B/B0（%）为纵坐标，在半对数纸上绘制出标准曲线。根据样品孔B/B0（%）值在标准曲线上读出6-酮-PGF1的含量。 样品6-酮-PGF1浓度（pg/ml）=测定值10。 参考范围10.725.1 pg/ml。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,血浆6-酮-前列腺素F1检测 应用评价,血浆6-酮-前列腺素F1是
11、血管内皮细胞膜上PGG2和PGH2代谢的终末产物，检测血浆中6-酮-前列腺素F1的水平能客观的反映血管内皮的功能，有助于对血管内皮损伤程度的了解和疗效评价。 血浆6-酮-前列腺素F1减低 见于血栓性疾病，如急性心肌梗死、心绞痛、脑血管病变、动脉粥样硬化、周围血管血栓形成及血栓性血小板减少性紫癜等。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,了解血小板的超微结构，在此基础上理解血小板的止血功能。 理解并掌握血小板止血功能实验室检查的临床应用及评价。,学习要点,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,第二节 血小板止血作用及检验,一、基本理论,血小板（blood platelet）由骨髓中成熟巨核
12、细胞的胞 质分割生成，是哺乳动物血液中体积最小的血细胞。 血小板数量：(100300) x109个/L（成年人）。 血小板寿命：710天。 主要功能：促进止血和加速凝血，在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中起重要作用。,血小板概述,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板结构,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,光学显微镜：一般表现为多形态，直径14m，具有运动和变形能力。瑞氏染色后见血小板胞质呈灰蓝色或淡红色，无胞核，中心部位有较多紫红色嗜苯胺蓝颗粒。 电子显微镜：血小板结构由外向内可分为表面结构、溶胶质层结构和细胞器内含物三层。,1血小板表面结构
13、由血小板膜、细胞外衣和开放管道系统（open canalicular system，OCS）组成。 重要成分：磷脂酰丝氨酸 （phosphatidylserine，PS）/血细胞第3因子（PF3） 血小板膜糖蛋白等。 2溶胶质层结构 由微管、微丝、致密管道系统等组成。 3细胞器内含物结构 主要致密颗粒和-颗粒、溶酶体组成。,血小板超微结构功能基础,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,花生四烯酸是膜磷脂代谢产物，其代谢途径是血小板发挥聚集止血功能的主要代谢基础。,血小板的花生四烯酸代谢途径,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板粘附,促凝作用,血小板聚集,释放反应,血块收缩,血小板的
14、止血功能,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板的止血功能,血小板的止血功能,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板的主要释放产物,血小板功能的实验室检查,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板粘附实验 PAdT，玻珠柱法,原理 血小板粘附试验（platelet adhension test，PAdT）利用血小板在体外可黏附于玻璃表面的原理设计，测定方法有多种，包括玻珠柱法、玻球法等。当血液与一定表面积的玻璃接触一定时间后，血小板粘附于玻璃表面，因此血液中血小板数会降低。通过计数接触前、后的血中血小板数，即可计算出血小板粘附率。该试验为判断血小板粘附能力的常用指标。,第
15、十三章 第二节 血小板止血作用及检验,PAdT 操作,将玻珠柱管（内径3mm，长9.4cm，内装直径0.30.5mm玻珠1.5g，管两端封以0.05cm孔径的尼龙布）与注射器相连； 行肘正中静脉穿刺； 当血液接触玻珠时开始计时，掌握好血液通过玻珠柱的速度。在4等分的玻珠柱中，血液通过每段速度为5s，共20s。经过玻珠柱后，再按原速抽血5s； 采集通过玻珠柱前后的血液，作血小板计数。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板粘附率（%）= 100% 参考值：62.5% 8.6 % 注意事项 取血过程必须顺利，掌握血液通过玻珠柱的速度。 待用玻珠柱应置于干燥器中储存，受潮后粘附率下降。 血小
16、板计数要准确，宜作23次后取平均值。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,PAdT 参考区间,PAdT 应用评价,血小板粘附率减低：见于先天性和继发性血小板功能异常（以后者多见），如血管性血友病、巨大血小板综合征、爱-唐综合征、低（无）纤维蛋白血症、异常纤维蛋白血症、急性白血病、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性疾病、肝硬化、尿毒症、服用抗血小板药物等。 血小板粘附率增高：见于血栓前状态和血栓形成性疾病，如高血压病、糖尿病、妊娠高血压综合征、肾小球肾炎、肾病综合征、心脏瓣膜置换术后、心绞痛、心肌梗死、脑梗死、深静脉血栓形成、口服避孕药等。 应用评价 是检测血小板功能的基本试验之一，用于遗传性与获得性血小板功能缺陷疾病的诊断、血栓
