课件：食品分析蛋白测定

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1、食品分析 Food Analysis,食品学院 丛 健 Tel：61900381 Email：J,第四章 食品的一般成分分析,水分的测定 灰分的测定 脂类的测定 碳水化合物的测定 蛋白质和氨基酸的测定 维生素的测定 酸性物质的测定,第五节 蛋白质和氨基酸的测定,蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。 在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。,蛋白质和氨基酸的测定,蛋白质是生命的物质基础，人体11%13%总热量来自蛋白

2、质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。 蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。,一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。例如 牛肉20.0%，猪肉 9.5%， 兔肉 21%， 鸡肉 20%， 牛乳 3.5%， 带鱼 18.0%， 大豆 40%， 面粉 9.9%， 菠菜 2.4%， 黄瓜 1.0%，苹果 1.4%,蛋白质的测定,蛋白质的测定方法分三大类： 一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量； 另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量 还有一类是使用色谱和质谱，通过色谱的分离，和质

3、谱的质量分析进行测定。 食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的要单测）。,具体测定方法,凯氏定氮法最常用的，国内外应用普遍。 双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法 红外分析仪、紫外分光光度法 液相色谱和飞行时间质谱,蛋白质的定量测定,一般情况下，蛋白质的含氮量一般为 15% 17.6%，有的上下浮动。据此，可以测出总氮 N，从而推算样品中蛋白质含量。 此数值（6.25）称为蛋白质系数，用F表示。不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25

4、，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。,凯氏定氮法,由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。 是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量。 此法的结果称为粗蛋白质含量：由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物，如核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物。 凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法，至今仍 被作为标准检

5、验方法。,三聚氰胺事件,2007.3，美国食品药品监督管理局(FDA)在中国出口的宠物食品原料小麦蛋白粉中查出三聚氰胺（C3N3H6），被怀疑是宠物中毒死亡的元凶。 之后，中国政府开始严打三聚氰胺、蛋白精。 饲料级蛋白精是以工业氮和异丁醛为原料在酸催化剂的情况下，经缩合反应而生成的，异丁叉二氮英文名：isobuty ildene diurea。（或尿素糊化淀粉，其蛋白高达100）,常量凯氏定氮法原理,样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。 用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。

6、根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。 也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。,常量凯氏定氮装置, 样品消化,2 NH2-(CH2)2 -COOH + 13H2SO4 (NH4)2 SO4 + 6CO2 + 12SO2 + 16H2O 浓硫酸的作用： 脱水作用使有机物脱水并碳化为C、H、N 氧化作用将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫 酸则被还原成二氧化硫 2H2SO4 C 2SO2 2H2O CO2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。,加入硫酸钾的作用：提高溶液沸点而加快有机物的分解（3400C

7、 4000C） K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3 但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失： （NH4）2SO4=NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O 除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。,加入硫酸铜的作用 催化作用：加速有机物的氧化分解 C 2CuSO4 Cu2SO4 SO2 CO2 Cu2SO4 2H2SO4 2CuSO4 2H2O SO2 此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。

8、 消化完全指示：蓝绿色； 蒸馏时碱性反应完全指示：变深蓝色或产生黑色沉淀。, 蒸馏 在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气 (NH4)2 SO4 + 2NaOH 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O 吸收 用硼酸溶液，并加入混合指示剂，硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.810-10），与氨形成强碱弱酸盐，酒红色蓝绿色 2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O, 滴定 待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定, 蓝绿色灰红色 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3,适用范围：此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定 仪器、试剂:

9、 500mL凯氏烧瓶、凯氏定氮装置 消化用： 浓硫酸 硫酸钾 硫酸铜 蒸馏用： 40%氢氧化钠溶液 吸收用： 4%硼酸 滴定用： HCl标准溶液 0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液混合指示剂,计算,式中： W蛋白质的质量分数，%； c盐酸标准溶液的浓度，mol/L； V1空白滴定消耗标准液量，mL； V2试剂滴定消耗标准液量，mL； m样品质量，g； 0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol； F蛋白质系数。,微量凯氏定氮装置,微量凯氏定氮装置,微量凯氏定氮法操作步骤 样品消化 蒸馏 吸收 滴定 样品消化 : 步骤：准确称取一定量的样品，加入硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20

10、mL、玻璃珠数粒小心移入干燥洁净的500mL凯氏烧瓶中(固体或粉末用纸卷成纸筒送入)，轻轻摇匀，以45斜支于有小孔的石棉网上用电炉以小火加热(或先烧瓶放在距电炉较远处)，待内容物全部炭化、泡沫停止产生后加大火力(或将烧瓶放在电炉上)，保持瓶内液体微沸至液体变蓝绿色透明后继续加热微沸30min关闭电炉，取下烧瓶、冷却转移至100mL容量瓶中，加水定容。, 蒸馏与吸收： 按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠。 在接受瓶中加入10mL 40g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。 准确吸取消化液1

11、0mL于反应管内，经漏斗再加入10mL氢氧化钠溶液，用少量蒸馏水冲洗漏斗，夹好漏斗夹并水封，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水进行蒸馏。 指示剂变绿色后继续蒸馏10min，将冷凝管尖端提离液面继续蒸1min。, 滴定 将接受瓶内的硼酸液用0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。,注意问题： 加入样品不要沾附在凯氏烧瓶瓶颈； 消化开始时不要用强火，要控制好热源，并注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全； 样品中若含脂肪或糖较多，在消化前应加入少量辛醇或液体石蜡或硅油作消泡剂，以防消化过程中产生大量泡沫；

12、消化完全后要冷至室温才能稀释或定容。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。,蒸馏、吸收注意问题： （1）整套装置不能漏气，要注意各蒸汽控制夹子的操作，以防蒸汽受阻爆炸或吸收液倒吸。 （2）在蒸汽发生瓶中要加入硫酸和甲基橙使呈酸性以防氨蒸出。 （3）加碱量要足，应使消化液呈深蓝色或产生黑色沉淀。操作要迅速，漏斗要采用水封防氨逸出。 （4）冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏；吸收液温度不应超过40，若超过时可置于冷水浴中使用；蒸馏完毕后，应先将,冷凝管下端提离液面，再蒸1分钟，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。 （5） 在

13、每次测定前及两次测定之间，均要洗涤反应管(倒吸法，在吸收瓶中加入蒸馏水，其余同测定时的做法，在蒸汽发生器中水剧烈沸腾后，立即移开电炉，水即从吸收瓶中倒吸入反应管，再倒吸入汽水分离管或蒸汽发生器中，打开夹子，即可放出废水。 （6）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。,(4) 结果计算 式中：W蛋白质的质量分数，%； c盐酸标准溶液的浓度，mol/L； V1空白滴定消耗标准液量，mL； V2试剂滴定消耗标准液量，mL； m样品质量，g； 0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol； F蛋白质系数。,分光光度法测定蛋白质含量,原理：试样与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白

14、质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后在pH=4.8的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，铵与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的化合物。在波长400nm处测定吸光度，与标准系列比较定量，结果乘以蛋白质系数，即为蛋白质含量。,分光光度法测定蛋白质含量,氨氮标准溶液（1.0g/L）：精密称取经105 干燥的硫酸铵0.4720g，用水溶解并定容至100mL ,临用时用水稀释至0.1 g/L,双缩脲法,双缩脲的性质：当脲被小心地加热至150160时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成双缩脲，其与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应。 蛋白质含有两个以上的肽键（与双缩脲中肽键相似），因此有双

15、缩脲反应。 在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，用吸收光度法来测定蛋白质含量，最大吸收波长为560nm。,双缩脲反应:碱性环境,多肽及蛋白质分子结构中均含有许多肽键，其结构与双缩脲分子中的亚酰胺键相同。因此，在碱性条件下与铜离子也能呈现出类似于双缩脲的呈色反应。其反应过程如下：,氨基酸的测定,双指示剂甲醛滴定法 电位滴定法 茚三酮显色法 氨基酸的分离及测定,氨基酸的测定,蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的最终产物为氨基酸。氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种，它们对人体有着极其重要的生理功能，常会因其在体内缺乏而导致患病或通过补充而增强了新陈代谢作用。,

16、氨基酸的测定,随着食品科学的发展和营养知识的普及，食物蛋白质中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的构成，愈来愈得到人们的重视。为提高蛋白质的生理效价而进行食品氨基酸互补和强化的理论，对食品加工工艺的改革，对保健食品的开发及合理配膳等工作都具有积极的指导作用。因此，食品及其原料中氨基酸的分离、鉴定和定量也就具有极其重要的意义。,氨基酸的测定,氨基酸的含量一直是某些发酵产品如调味品的质量指标，也是目前许多保健食品的质量指标之一，其中的含氮量可直接测定，不同于蛋白质的氮，故称为氨基酸态氮。氨基酸态氮反映的是样品中游离氨基酸的总量。,氨基酸态氮的测定,双指示剂甲醛滴定法,电位滴定法,双指示剂甲醛滴定法,原理 氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛