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1、探索性医学综合实验教学改革与实践（第五期）贞草方对小鼠CCl4急性肝损伤的保护作用张艺宝 陈瑛 周晨 陆聆韵 蒋金波指导老师：徐列明（上海中医药大学03中医临床七年制，上海201203）摘要目的：研究贞草方（女贞子和甘草按3：2配伍）对小鼠CCl4急性肝损伤的保护作用。方法：将动物随机分为正常组、CCl4模型组、女贞子组、甘草组、贞草方低剂量组、贞草方高剂量组，后4组先分别灌胃给与相应中药6d，然后1次性腹腔注射CCl4。检测血清中TBiL含量、ALT和AST活性，观察肝组织病理变化。结果：所检测的指标值中CCl4模型组与正常组相比差异无统计学意义(P0.05)。各给药组与模型组比较以及各给药
2、组之间比较，所检测的指标值差异亦无统计学意义(P0.05)。肝脏病理学观察显示各组小鼠肝损伤虽有一定程度的差异，但也不是十分明显。结论：本次试验造模不成功，未见贞草方对小鼠CCl4急性肝损伤具有十分明显的保护作用。关键词女贞子；甘草；急性肝损伤；生化指标；病理组织学女贞子(fructus ligustri lucidi)系木樨科常绿乔木女贞的干燥成熟果实，性味甘、微苦、凉，归肝、肾经，具有滋补肝肾，明目乌发的功能1。甘草系豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）、胀果甘草（G inflate Bat）或光果甘草(Gglabra L)的干燥根及根茎，性味甘、平，归心
3、、肺、脾、胃经，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效2。药物配伍使用是中医治疗的特色，本试验研究贞草方（女贞子和甘草按3：2配伍）对小鼠CCl4急性肝损伤3的保护作用。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 动物 ICR雄性小鼠72只，清洁级，体重1822g，购于上海西普尔必凯实验动物有限公司，合格证号：SCXK(沪)2003-0002，由上海中医药大学实验动物中心饲养。1.1.2 药品 女贞子颗粒剂（江阴天江药业有限公司，批号0701171）每袋装1g,相当于饮片10g。甘草颗粒剂（江阴天江药业有限公司，批号0702015）每袋装0.5g，相当于饮片3g。配制女贞子组溶液
4、浓度为0.0252g/ml,相当于生药浓度0.252g/ml；甘草组溶液浓度为0.0280g/ml,相当于生药浓度0.168g/ml；贞草方低剂量组溶液浓度为0.0532g/ml,相当于生药浓度0.420g/ml；贞草方高剂量组溶液浓度为0.124g/ml,相当于生药浓度0.980g/ml。1.1.3 试剂 CCl4（国药集团化学试剂有限公司，批号20061114）、橄榄油(国药集团化学试剂有限公司，批号F20040614)、甲醛（国药集团化学试剂有限公司，批号JH20060110）。1.1.4 仪器 自动生化分析仪、组织自动脱水机、组织包埋机、石蜡切片机、摊片机、烘片机、光学显微镜等。1.2
5、 方法1.2.1 动物分组 将72只小鼠随机分为正常组、CCl4模型组、女贞子组、甘草组、贞草方低剂量组、贞草方高剂量组，每组12只。1.2.2 给药方法 置温度2022，湿度4850 的实验室适应环境4d后试验。自试验之日起各中药组小鼠每天给与相应的中药灌胃1次，灌胃量0.25ml/10g体重，给药量见表1。除贞草方高剂量组给药量相当于成人常用量的70倍外，其他各组给药量相当于成人常用量的30倍。正常组和CCl4模型组给予等量蒸馏水。每天灌胃1次，连续灌胃6d。1.2.3 模型制备 末次给药1h后，除正常组腹腔注射生理盐水（10ml/kg体重)外，其余组均采用一次性腹腔注射CCl4（0.12
6、5%溶液，10ml/kg体重) 复制急性肝损伤小鼠模型4。1.2.4 样品的采集和处理 CCl4注射后1d称小鼠体重，摘眼球取血，脊柱脱臼处死，称肝脏重量，计算肝指数（肝指数肝脏重量/小鼠体重），留取血清和肝组织样本作肝功能检测和病理学观察。1.2.5 肝功能检测 以自动生化分析仪检测血清ALT和AST活性以及TBiL含量。1.2.6 肝脏病理学观察 留取约553 mm3相同部位的肝组织，10中性福尔马林固定，逐级酒精脱水，石蜡包埋。切片厚4mm，作常规H-E染色，光镜下观察肝脏组织结构、肝细胞变性坏死和炎症细胞浸润等病理变化。1.2.7 统计方法 实验数据以均数标准差(s)表示，计量资料用统
7、计分析软件SPSS12.0中的ANOVA程序进行单因素方差分析，对于方差齐的数据采用SNK法检验，对于方差不齐的数据采用Games-Howell法检验，P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 肝指数的变化 由表1可见，模型组与正常组比较，差异无统计学意义，各给药组与模型组比较，所检测的指标值差异亦无统计学意义。表1 贞草方对小鼠肝指数的影响 组别 n 各组因灌胃 给药量 相当于生药量 肝指数 （只）死亡数（只）（g/kg.b.w） （g/kg.b.w）正常组 7 5 - - 0.04910.00687 模型组 7 5 - - 0.04890.00390 女贞子组 5 7 0.63 6.3
8、0 0.04350.01030 甘草组 7 5 0.70 4.20 0.04820.00502 低剂量组 7 5 1.33 10.50 0.04540.00509 高剂量组 9 3 3.10 24.50 0.04970.00499 2.2 血清TBiL、ALT、AST含量变化 由表2可见，模型组与正常组比较，差异无统计学意义，各给药组与模型组比较，所检测的指标值差异亦无统计学意义。表2 贞草方对小鼠CCl4急性肝损伤的血清生化指标的影响 组别 n TBiL ALT AST (mmol/L) (IU/L) (IU/L)正常组 5 9.201.62 43.008.28 103.607.44模型组
9、5 7.722.03 52.0014.78 138.5040.55 女贞子组 2 6.651.34 54.5010.61 181.005.66 甘草组 6 7.180.58 148.33100.87 223.33150.04 低剂量组 5 8.041.30 133.8081.34 140.2010.76高剂量组 5 8.680.73 45.0021.86 157.4063.44注：除去一组特异数据。该组样本例数为6。2.3 肝脏病理改变正常组小鼠的肝脏结构正常，肝索排列规则，肝细胞形态无改变。模型组小鼠的肝脏结构紊乱，小叶间界限不清，肝细胞有较广泛的胞浆疏松，部分呈小泡状脂肪变性；肝窦扩张，库
10、普佛细胞增生。与模型组相比，各用药组小鼠肝脏结构改变较轻，变性肝细胞的程度和范围也略低，肝窦有不同程度的扩张，其中甘草组和贞草方高剂量组小鼠的肝窦充血较明显，见图1。 正常组 模型组 女贞子组 甘草组 贞草方低剂量组 贞草方高剂量组 图1 小鼠的肝脏病理改变(HE，X200)3 讨论3.1 CCl4致小鼠急性肝损伤的原理与检测指标 CCl4是一种典型的肝脏毒物，CCl4经肝脏微粒体细胞色素P-450激活后，产生活泼的三氯甲基自由基(CCl3)，三氯甲基自由基可攻击肝细胞膜上的磷脂分子，引起脂质过氧化反应，并可与肝细胞微粒体脂质和蛋白质发生共价结合，损伤细胞膜的结构和功能，从而使肝脏的可溶性酶的
11、活性提高。并且CCl4可以抑制内质网上的钙离子泵，使钙离子水平增加，升高的钙离子可激活肝细胞膜上的磷酸化酶，从而引起膜的脂质过氧化，导致肝细胞膜的损伤5。CCl4损伤细胞膜，最终引起细胞坏死6，导致肝细胞内的一些酶类进入血液。肝细胞内转氨酶的含量约为血中含量的100倍，只要有l的肝细胞坏死，就促使血清中转氨酶活力增加1倍。由于肝细胞转氨酶浓度比血清中高，当肝细胞膜通透性增加时，即使无坏死，细胞内转氨酶也可因明显的浓度梯度差而渗入血中，因此，血清转氨酶(ALT、AST等)是肝细胞损伤的敏感指标，血清转氨酶的升高在一定程度上反映了肝细胞的损伤程度7。在胆红素(胆汁成分)的代谢过程中，肝细胞承担着重
12、要任务。首先是衰老红细胞分解形成的间接胆红素随血液循环运到肝细胞表面时，肝细胞膜微绒毛将其摄取，进入肝细胞内，与Y、Z蛋白固定结合后送至光面内质网中，靠其中葡萄醛酸基移换酶的催化作用，使间接胆红素与葡萄糖醛酸结合成直接胆红素(色素I、II混合物)；在内质网、高尔基氏体、溶酶体等参与下直接胆红素排泄到毛细胆管中去。可见肝细胞具有摄取、结合、排泄胆红素的功能。当CCl4使肝脏细胞功能减退，受损坏死，致部分直接、间接胆红素返流入血，导致血清中总胆红素（TBiL）升高。故TBiL的含量可间接反映CCl4所致小鼠的肝组织细胞损伤的程度。3.2 贞草方的保肝原理 3.2.1 女贞子 本品主要含齐墩果酸、熊
13、果酸、棕榈酸、油酸、亚油酸等。药理研究证明女贞子中齐墩果酸具有增强免疫，保肝降酶，抗动脉粥样硬化，降血脂，降血糖等作用，女贞子提取物同时还有升高白细胞，抗衰老，耐缺氧，抗炎等作用8。现有实验证明齐墩果酸(Oleanolic acid，OA) 对CCl4引起的大鼠急性肝损伤有明显的保护作用9 、10 ，可血清ALT含量明显下降，肝脏脂肪变性或坏死减轻，肝内甘油三酯蓄积减少11。根据超微结构观察，肝细胞内线粒体肿胀与内囊泡减轻，并能促进肝细胞再生。临床应用也表明从女贞子中提取的OA治疗急性黄疸性肝炎患者70例，有效率为94.3，治愈率为8012。京、沪、渝等地9所医院观察用齐墩果酸治疗的222例慢性肝炎患者，其总有效率69.8 ，显效率43.713。3.2.2 甘草 药理学研究表明甘草所含甘草甜素、甘草酸、甘草甙元、黄酮、多糖等生理活性成份具有保肝，抗炎，调节免疫系统，抗癌，抗病毒，抗菌，改善心血管系统，抗氧化，解毒等作用14。甘草中甘草甜素含量为6%12%，是甘草甜味的主要来源。甘草甜素具有保肝作用15。口服甘草浸膏对CCl4、甲基偶氮苯、扑热息痛所致肝损伤有明显的保护作用
