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1、大水榕快繁体系的构建 二一一年六月目 录前 言41、 材料与方法51.1材料、试剂与仪器51.1.1材料51.1.2试剂51.1.3仪器51.2实验步骤61.2.1器皿的洗涤61.2.2培养基配制与灭菌61.2.3外植体的采取61.2.4外植体的消毒71.2.5外植体的接种71.2.6不定芽培养、继代培养71.2.7观察并记录实验结果72、 结果与分析82.1消毒时间对大水榕外植体的影响82.2激素配比对大水榕愈伤组织的诱导作用92.3激素配比对大水榕愈伤组织的再分化作用102.4激素配比对大水榕不定芽的诱导作用102.5激素配比对大水榕不定芽继代培养的影响112.6激素配比对大水榕不定芽生根
2、培养的影响122.7大水榕试管苗出瓶标准的建立133、 结 论134、 讨 论14参考文献：14附录1 MS培养基母液配制表15附录2 大水榕试管苗照片16大水榕快繁体系的构建摘 要：大水榕是一种中高档观赏水草，其作为中后景水草效果颇佳，但繁殖速度极慢，且不易获得。本实验以大水榕不同部位（腋芽、幼叶和嫩茎）作为外植体，通过组织培养技术构建大水榕的快繁体系。结果表明：*作为外植体效果较好，消毒*min为宜；适宜大水榕不定芽诱导和继代培养的激素配比分别为* mg/L +*mg/L和*mg/L +* mg/L；大水榕在培养过程中可自然生根；适合大水榕不定芽增殖和继代培养的蔗糖浓度为*g/L；大水榕试
3、管苗出瓶标准为：株重*g以上，株高*cm以上，根数达*根或者更多，平均根长在*cm以上。关键词：大水榕,快繁体系, 消毒时间, 激素, 蔗糖浓度, 出瓶标准 Abstract: The Anubias barteri var is a kind of high-grade watch as the grasses, especially as the foreground aquatic breeding, but this plant reproduces extremely slowly and is not easy to obtain. The experiment was to es
4、tablish rapid propagation system of Anubias barteri var through different explants ,such as axillary, tender leaves and stem.The results indicated that: (1) the * as explant was better, sterilizing time was13min; (2) The suitable medium to induct bud was *mg/L +* mg/L , the subculture medium was*mg/
5、L + * mg/L; (3)The tissue culture seedling can root naturely during cultivation; (4) The appropriate sucrose concentration to inducting bud and subculture was *g/L; (5)the standards of the seedling for out of bottle were the weight over * g, the plant height over * cm ,the root number more than*, an
6、d the average root length over* cm.Key words: Anubias barteri var, Rapid propagation system, Sterilizing time, Plant hormone, Sucrose concentration, the standard of seedling 前 言随着我国人民生活水平不断提高，水族箱以及陆生动物培养箱愈来愈普及，对于观赏性水草的需求愈来愈大。但是由于我国观赏性水草大多进口国外，且价格贵，我国每年会损失大量外汇，同时也抑制我国观赏水草市场的蓬勃发展。为此，利用外国良好的观赏水草资源和现代技术
7、手段，将其转化为我国的优势，弥补我国观赏水草的不足，并促进我国观赏水草市场的繁荣。 大水榕（Anubias barteri var）是一种生长缓慢、叶片比较坚挺、翠绿的水草。叶片呈倒卵形，有叶耳，叶柄基部具鞘，佛焰苞席卷，浆果包裹在焰苞内，近球形，原产地是非洲，属天南星科(Araceae)榕叶属植物1。大水榕为非常典型的中高档观赏水草，作为中后景效果颇佳，形态优美，且由于叶片坚硬，食草鱼类不易啃食，另外，还适合在陆生动物饲养箱内种植，例如龟类的等。但因其雌雄异株且籽株胎生，难获得正常繁育的种子。大水榕以无性繁殖为主，通过根茎侧芽分蘖形成新的植株，繁殖速度极慢，种苗稀缺，其价格昂贵，且需进口方可
8、满足市场需求，这制约着大水榕在我国市场的发展2。植物组织培养技术是在植物细胞的全能性上建立起来的。所谓植物细胞全能性是指植物体的每一个活细胞都具有该植物的全套遗传信息，于合子一样，具备发育成完整植株的潜能3。植物的组织培养过程中，消毒时间会影响植物外植体在组织培养过程中的污染情况和褐化率4。生长素与细胞分裂素的含量及比例是影响植物生长的关键因素。蔗糖可以为培养基提供碳源和能源，为细胞提供合成新化合物所需的碳骨架，并为细胞代谢提供底物与能源，维持一定的渗透压5。关于水草组织培养的研究比较少，主要有迷你宝塔、红柳、小对叶、大红叶、大青叶 6等。前人已对小水榕的组织培养条件7进行了研究，但对大水榕的
9、组织培养与快速繁殖在国内外的研究鲜有报道。植物组织培养技术可成倍提高大水榕繁殖速度，提供大量的优质种苗，解决大水榕自然繁殖速度慢的问题，满足市场需求，同时可大大降低种苗成本，大水榕的前景与发展空间很大8。另外，可以大水榕作为天南星科的模式植物，构建天南星科植物的组织培养技术，具有一定的参考价值。为此，本实验在研究大水榕组织培养的适宜外植体基础上，探讨消毒时间、激素配比以及蔗糖浓度对大水榕组织培养的影响，构建大水榕的快繁体系，提出大水榕试管苗的出瓶标准，以期为其大规模的工厂化生产提供理论依据和技术基础。进一步进行扩大试验，进行工业化生产，在短的时间内，最大化生产优质种苗，解决大水榕在自然界繁殖速
10、度慢的现实难题，满足我国市场需求。1、 材料与方法1.1材料、试剂与仪器1.1.1材料大水榕，由合肥观赏水草市场购买。1.1.2试剂蔗糖，购于合肥国购家乐福超市。琼脂，福建莆田市秀屿区平海琼脂厂生产。6-BA，即6-苄基腺嘌呤NAA，即萘乙酸CPPU，即1-(2-4氯-4-吡啶基)-3-苯基脲2-4-D，即2,4-二氯苯氧乙酸MS培养基母液，在校生命科学学院细胞实验室配制（附录1）。70%酒精、95%酒精和0.1%升汞。无菌水，由莆田牌纯水机制得。1.1.3仪器电炉、铝锅、高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱、超净工作台、玻璃棒、培养皿、试管、移液管、量筒、烧杯、锥形瓶、玻璃瓶、洗耳球、橡皮圈、封口膜、
11、塑料平板、酒精灯、纱布、解剖刀、剪刀、镊子。1.2实验步骤1.2.1器皿的洗涤将试管、移液管、锥形瓶等玻璃仪器和剪刀、镊子等金属仪器用洗涤剂清洗和清水清洗之后，将上述仪器用干热灭菌（160灭菌1.5h）的方法进行灭菌。1.2.2培养基配制与灭菌基础培养基： :MS培养基愈伤诱导和和分化培养基：:MS+6-BA*mg/L + NAA *mg/L:MS+6-BA * mg/L + NAA * mg/L:MS+6-BA* mg/L + NAA *mg/L :MS+6-BA * mg/L + NAA *mg/L不定芽诱导和继代培养基：:MS+CPPU * mg/L + 2,4-D *mg/L:MS+C
12、PPU *mg/L + 2,4-D *mg/L:MS+CPPU* mg/L + 2,4-D * mg/L:MS+CPPU * mg/L + 2,4-D * mg/L以上培养基中均含有琼脂*%，将上面的培养基分成两组，一组蔗糖浓度为*g/L，另一组蔗糖浓度为*g/L。调培养基pH至*，*高压灭菌*min。1.2.3外植体的采取 选取健壮的大水榕腋芽、幼嫩的叶片和嫩茎为外植体，用少量洗衣粉轻轻浸泡洗净表面脏物，后经流水轻轻冲洗。1.2.4外植体的消毒在超净工作台上先用*酒精浸泡*s，将腋芽、幼叶和嫩茎分别都用*升汞溶液消毒* min、*min、*min、*min和*min，取出后用无菌水漂洗*次，
13、待用。1.2.5外植体的接种在超净工作台上将腋芽分开，将幼叶切成*cm*cm大小，将嫩茎剪成*cm长短，分别成“品”字型接种于含有培养基的玻璃瓶中。其中腋芽接种于不定芽诱导培养基，幼叶和嫩茎接种于愈伤组织诱导培养基。1.2.6不定芽培养、继代培养 根据大水榕不同外植体生长到不同阶段，接种到相应的培养基上培养。当幼叶和嫩茎去分化行成愈伤组织时，接种于愈伤组织分化培养基上，待分化产生不定芽时，将不定芽先分开再接种于继代培养基上；腋芽诱导产生不定芽时，接种于继代培养基上。在继代培养基上分开不定芽丛，成“品”字型接种于新鲜培养基上，进行培养。1.2.7观察并记录实验结果刚开始接种之后，每隔12h观察一
14、次并转接到相应的新鲜培养基上，记录被污染的外植体数目、外植体褐化数目和存活数目，最后统计，通过污染率、褐化率以及存活率得出较适宜的消毒时间并确定较适宜培养的外植体；四周以后统计幼叶和嫩茎诱导产生愈伤组织的比例，二个月后统计愈伤分化率，确定在传统的组培途径中适宜的激素配比；一个月之后和三个月之后统计不定芽的增殖倍数，不定芽的增殖倍数=培养结束时的芽数与培养初期芽数的比值。测定平均株重、平均株高、平均根长和根条数等形态学指标，株高、根长用标卡尺进行测量，株重用电子天平进行测量。每个指标测定10株，取平均值。通过对比确定适宜的继代培养激素配比和生根激素配比以及建立出瓶标准。2、 结果与分析2.1消毒
15、时间对大水榕外植体的影响 表1表明，腋芽消毒时间在*min内，随着消毒时间的延长，污染率逐渐降低至*%，*min之后，污染率基本无变化，到*min时，污染率为*%；幼叶在*min内，随着消毒时间的延长，污染率逐渐降低至*%，在*min之后污染率基本无变化，达*%；嫩茎随着消毒时间的延长，污染率基本无变化，约为*%。通过表1还可见，腋芽消毒时间在*min内，随着消毒时间的延长，褐化率基本无变化，在* %左右，至*min时，而褐化率上升较快，到*%；幼叶在*min内，随着消毒时间的延长，褐化率基本无变化，至*min是为*%，在*min之后褐化率上升很快，达*%；嫩茎随着消毒时间的延长，褐化率愈来愈高。由此
