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1、血清白蛋白的分离、纯化与鉴定,血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，约占总量的60。它是一种水溶性很强的蛋白，结构稳定，能结合多种小分子，如脂肪酸，胆红素，血红素等，起维持血液的正常渗透压作用。此外白蛋白还有解毒、参与脂类代谢及血浆中微溶物质的运输、维持血液酸碱平衡等作用，在医学临床及生物领域应用广泛 。,实验目的,掌握血液样品的正确处理和制备方法掌握血清白蛋白粗分离的一般方法掌握离子交换法分离纯化蛋白质掌握蛋白质纯度检测的方法掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理和方法学会考马斯亮蓝法测定蛋白质含量,原理与操作,血清的制备,白蛋白的分离,白蛋白的纯化,蛋白质含量的测定,白蛋白纯
2、度的检测,白蛋白的相对分子质量的测定,留样：2，3,留样：4,留样：1,一、血清白蛋白的分离,1 采血 2 血清分离 3 盐析法分离血清白蛋白4 除盐,收集血清： 取2 mL血液，4 ，3,000 rpm离心15 min，用移液枪吸取上清（血清）1 mL至10 mL离心管；留0.1mL（样1）至1.5 mL离心管，用于测定蛋白质含量和电泳.,盐析：中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。分级盐析实现蛋白质的分离纯化。在血清中加入硫酸铵，当饱和度为50%时，血清白蛋白不沉淀，球蛋白析出，饱和度达55%，白蛋白析出
3、。,量筒量取9 ml底液（50 %的饱和硫酸铵溶液），用移液管逐滴加入，不断摇晃。4 静置2 h；4 ，13,000 rpm离心20 min，收集上清，留0.5 ml（样2）至1.5 ml离心管，用于测定蛋白质含量和电泳；,用5%的柠檬酸缓冲液调节pH至4.5，用量筒确定上清液的体积，计算加入饱和硫酸铵（pH4.5）的体积（0.11V）；逐滴加入饱和硫酸铵（pH4.5），振荡，4 静置2 h；4 ，3,000 rpm离心20 min，弃上清，沉淀用0.5 mL pH7.4的柠檬酸缓冲液溶解，置透析袋中，放入pH 7.4的柠檬酸缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无NH4存在；留0.1 ml（样
4、3）至1.5 ml离心管，用于测定蛋白质含量和电泳；NH4的检测：奈氏试剂,奈氏反应,奈氏试剂是络盐K2HgI4加KOH的溶液，在无机化学定性分析中，用其检验氨或铵盐,砖红色的溶液或沉淀,二、血清白蛋白的纯化,离子交换柱层析：离子交换柱的安装平衡加样洗脱样品收集,在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此之间的静电吸引。蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中盐离子浓度或pH来完成，对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。本实验采用的DEAE纤维素离子交换剂.,层析洗脱，可以采用保持洗脱液成分一直不变的方式洗脱，也可采用改变洗脱的盐浓度和（或）pH的方式洗脱，后一种方式又可
5、以分为两种：一种是跳跃式的分段改变（梯度洗脱），另一种是渐进式的连续改变（连续洗脱）。,除硫酸铵后的白蛋白溶液在0.02mol/L pH7.4 醋酸铵缓冲液的条件下，加到二乙氨乙基（DEAE ）一纤维素层析柱上，在此pH 时，DEAE -纤维素带有正电荷，它能吸附带负电荷的白蛋白、及球蛋白（血清白蛋白等电点为4 . 9 ，绝大多数。及球蛋白等电点均小于6 ）。随着盐离子浓度的提高，离子交换柱上的球蛋白、球蛋白、白蛋白依次被洗脱下来。,DEAE-纤维素离子交换层析：装柱：将层析柱垂直固定。将DEAE-纤维素装入柱内，至8-10cm高度，平衡过夜；洗脱液流速调节为 1mL/min；上样：将透析袋剪
6、开，用移液管转至层析柱内，待样品进入凝胶后再加入少量缓冲液，使样品完全进入胶内；洗脱：采用连续梯度洗脱，用0.021.0molL醋酸醋酸铵缓冲液（pH7.4）进行洗脱，收集；记录出现峰值的管号(样品4,)洗脱速度慢，可直接换B液（ 1.0molL醋酸醋酸铵缓冲液）,五、血清白蛋白的相对分子质量测定 -SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小（分子量）有关，如电荷、形状都一样，则电泳迁移率只与分子量有关。,SDS的作用：1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能使二硫键断裂，使蛋白质完全变性；2.能与变性的蛋白质按比例结合，形成SDS-
7、蛋白质复合物。SDS-蛋白质复合物的特点：1. 由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态；2.复合物都是椭圆棒状。因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子量大小。,测定各条带的相对迁移率，根据已知蛋白质分子量和它们的相对迁移率，以相对迁移率为横坐标，lgMW为纵坐标作标准曲线。根据未知蛋白质的相对迁移率从标准曲线上查出它们的lgMW，再换算成蛋白质分子量,测定各条带的相对迁移率，根据已知蛋白质分子量和它们的相对迁移率，以相对迁移率为横坐标为lgMW为纵坐标作标准曲线。根据未知蛋白质的相对迁移率从标准曲线上查出它们的lgMW，再换算成蛋白质分子量,在一定范围内，蛋白质的迁移率和
8、分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-Bx（MW为分子量，X为迁移率，k、B均为常数）若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,计算猪血白蛋白的分子量 ：logMW=K-Bx,胶的制备,样品的处理 向标准蛋白质或待测样品中按比例加入上样缓冲液，充分溶解后，加盖（不要密闭），置沸水浴3 min，取出冷至室温。上样顺序：标准蛋白；样品1；样品2；样品3；柱层析高峰管号的蛋白质样品4,；加样量：20L.,电泳：点样端负极，恒压：开始80V，待样品进入分离胶后120V。电极缓冲液：
9、pH 8.3 Tris Gly染色：脱色考马斯亮兰R-250，过夜。脱色：先用蒸馏水冲洗凝胶，再用脱色液（冰醋酸：蒸馏水：甲醇=75：875：50）脱色1-3h。,四、考马斯亮兰法测定蛋白质含量考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250 -蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度.在一定范围内，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物呈色后，在595nm 下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定,操作 （mL）,标准蛋白液：50g/ mL；样1、2、3稀释100倍样
10、1稀释600倍（10 l6ml）；样2、3稀释200倍（10 l2ml）；各峰稀释5-10倍（10 l6ml）,按上表加好试剂后摇匀，以0管为对照，于595nm处测定光吸收值，以管做出标准曲线；各样品的光吸收值，取平均值，从标准曲线中查出蛋白质的g数。,三、血清白蛋白纯度的检测,- 聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳法,A、胶的制备,B 加样：各步骤留样的样液；层析后的蛋白峰。样品的处理：样品加等量的40%蔗糖溶液、一滴0.1%溴酚蓝。加样量：20l样品+ 5(.C 电泳：点样端负极，恒压，开始80V，待样品进入分离胶后120V。电极缓冲液：pH 8.3 Tris GlyD 染色：脱色考马斯亮兰R-250，过夜。E 脱色：先用蒸馏水冲洗凝胶，再用脱色液（冰醋酸：蒸馏水：甲醇=75：875：50）脱色1h。,【结果与分析】,
