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1、实验二 微量凯氏定氮法测定 蛋白质含量,实验目的,学习微量凯氏定氮法的原理 掌握微量凯氏定氮法的操作技术（未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等）,实验原理,凯氏定氮法常用于测定天然有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等）的含氮量。 当天然含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢被氧化成二氧化碳和水，而氮则变成氨并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程称为“消化”。 此过程进行的相对较为缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。氧化剂过氧化氢也能加速反应。,消化过程 ：,蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反
2、应方程式如下：,吸收与滴定：蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止（即滴定至蓝紫色)，最后根据所用标准酸的当量数（相当于待测物中氨的当量数）计算出待测物中的氮量。,实验材料与试剂,实验材料：食用面粉 实验试剂： 浓硫酸 30%氢氧化钠溶液 克氏催化剂 2%硼酸 指示剂 0.01M HCL,实验器材,凯氏烧瓶 电炉 凯氏定氮蒸馏装置 锥形瓶 100ml容量瓶 酸式滴定管,操作步骤,消化： 准确称取1克食用面粉，用称量纸卷好小心送入至50毫升的凯氏烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上。向另一烧瓶加入1ml水作空白对照。 在每个烧瓶内加入
3、硫酸钾硫酸铜混合物（克氏催化剂）少许，浓硫酸10ml，小瓷片两粒，摇匀。将烧瓶约60度角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在通风厨内的电炉上消化。 在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明绿色为止。消化完毕，待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10ml（注意慢加，边加边摇）。冷却后将瓶内容物转入100ml的容量瓶中，并用蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度摇匀，做上记号备用。,蒸馏： 仪器的洗涤：,蒸馏器洗净后，开放水龙头P3，使水进入A室，水放至A室球部即可。 取3个50ml的锥形瓶，各准确
4、加入10ml硼酸（内加有混合指示剂）。用表面皿复盖备用。 A、加样：用吸量管吸取2ml消化液，细心地由漏斗D倾入蒸馏室，再用蒸馏水1毫升清洗漏斗。取一个盛有硼酸混合指示剂的锥形瓶，置于M管下，使管口恰好接触硼酸溶液，用量筒从漏斗D加入30%氢氧化钠5ml，随即将P4夹紧，并往漏斗加入少量蒸馏水封闭。,B、蒸馏：用酒精灯加热（应用挡风板将灯围拢，维持火力恒定，沸腾不可高于Y管口以免A室溶液从Y管倒吸，待第一滴蒸馏液从冷凝柱F顶端滴下时起，继续蒸3-5分钟，然后将锥形瓶放低，使导管离开液面再蒸2分钟，最后用蒸馏水洗导管外壁，蒸馏完毕，取下锥形瓶，随即将蒸馏器洗净。） C、样品及空白蒸馏：用吸量管分
5、别吸取2ml样品和2ml空白按上述操作步骤进行蒸馏。,滴定： 蒸馏完毕，用微量酸式滴定管，以0.01mol/L 盐酸标准溶液进行滴定锥瓶内溶液，溶液由蓝绿色变为淡紫色或灰色，即为终点。记录所用盐酸的量。,计算： 若测定的样品含氮量部分只是蛋白质则： 样品的总蛋白含量（克蛋白%）= 式中：A为滴定样品用去的盐酸平均毫升数； B为滴定空白用去的盐酸平均毫升数；（使用空白对照，木的是考虑到被滴定液种种可能含有能与盐酸反应的杂质而消耗了盐酸） C为称量样品的克数：0.0100为盐酸的当量浓度（实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写）； 14为氮的原子量； 6.25为常数（1毫升0.1N盐酸相当于
6、0.14毫克氮）。,注意事项,本法适用于0.05-3.0mg氮，样品中含氮量过高时，则应减少取样量或将样液稀释。 勿使样品粘于烧瓶颈部。放置液体样品时，需将吸管插至烧瓶底部再放样：如固体样品，可将样品卷在纸内，平插入烧瓶底部，然后再将烧瓶直起，纸卷内的样品即完全放在烧瓶底部。,蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后移开酒精灯，绝不能先灭灯，否则吸收液将发生倒吸。 硼酸吸收液的温度不应超过40C，否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。 混合指示剂在碱性溶液中呈兰绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。,思考题：,写出一下各步的化学反应方程式: 蛋白质的消化 氨的蒸馏 氨的滴定 指出本测定方法产生误差的原因 消化过程中产生何种有毒气体？如何判断消化终点？,
