《国外生物制品质量标准2010年药典会》由会员分享，可在线阅读，更多相关《国外生物制品质量标准2010年药典会（55页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、国外生物制品检验方法研究进展,王军志 中国药品生物制品检定所,提纲,一.国际交流促进了质量标准研究与发展 二. 高端理化方法用于生物制品质量研究 三.新生物学活性测定方法的研究 四 .热源检测替代方法研究,一. 国际交流促进了质量标准研究与发展,WHO 英国NIBSC 德国PEI 加拿大CBR 美国USP,测量学（Metrology）：,测量结论基础: 方法验证（Validation） 追溯（Traceablity） 不确定性（Uncertainty） 随着测量技术进步，新的分析测量手段应用于生物测量中，如: 芯片技术开发在基因水平对测序的评价方法。,关于标准溯源（Traceablity Ch
2、ain）：,国际标准（SI） NMI 药典（Pharmacopoeias） 协作标定实验室（Calibration Labs） 常规测定实验室（Routine Measurement Labs）,Bio-measurements主要含义：,1. 采用生物学方法进行测量包括生物测定（Bioassays）、动物水平,细胞水平,分子水平的定量测定等。 2. 对生物制品本身结构特性的测定，如圆二色分析蛋白质、分子结合物表面共振分析等。 对于复杂的蛋白分子，理化测定方法虽然可以提供比较多的结构信息，但其不能完全反映蛋白质的高级结构。虽然生物学活性的测定值可信限范围比较大，但其作为特异的定量方法仍被广泛应
3、用。 只有在理化结构的测定比较全面彻底，并且理化测定方法与生物学活性测定方法关系明确，同时生产工艺稳定时，理化方法才可以替代生物学活性测定方法。,近年来随着新技术、新产品的出现，而使生物测量的含义不断得到充实和扩展：,基因递送体系的发展（基因治疗） 细胞治疗的发展（干细胞治疗） 生物相似性概念的发展 NIBSC在生物测量中有三个比较突出的进展： 免疫反应定量检测方法 将蛋白质组学技术用于疫苗的质量分析 生物测定终点法的合理发展（“Rational development of bioassay end-points.”）,英国NIBSC重点研究方向：,针对基因治疗载体的分析方法研究 干细胞分化
4、状态下，抗原表达分析 治疗用糖蛋白生物活性与糖基化相关性研究 细胞因子治疗病人的抗体分析标准方法 采用定量、伦理方式改善及替代测定方法 以毒素效价为基础的毒性评价方法,NIBSC将蛋白组学在疫苗质量控制中的应用：,以Meningococcal OMV vaccine为例， 采用I-D SDS-PAGE电泳法，可以得到29条区带，采用质谱分析出40种蛋白多肽的序列。其中证明7种为关键抗原成份。 采用二维电泳法（2D-PAGE）发现152斑点，采用MS/MS法分离出74个多肽位段可以代表41个不同基因的产物。 采用2D-PAGE法分析两个企业同类产品，斑点数有显著差异。 免疫蛋白组学可以通过分析混
5、合蛋白，研究哪些是有用，哪些是无用的，从而确定抗原保护成份。,Example: Complexity of vaccines,Proteomics-based identification of antigenically-active components present in OMV Vaccines against Meningococcal group B disease,Is the concept of a “biological” (not characterisable by physico-chemical means alone) still valid?,生物测定终点法,
6、以细胞早期分子变化测定为基础： VEGF的生物学测定采用细胞内信号变化进行。q-PCR检测mRNA表达水平。通过IL-8mRNA诱导的VEGF活性测量。 通常采用抗病毒检测法测定-干扰素活性需要3天，而q-PCR法8小时就可以达到目的。 RNA可直接通过细胞裂解物测定，不需要纯化或酶处理。 生物测定终点法的发展（Bioassay end-point development）： q-PCR方法可直接测定细胞早期的成份变化，可减少差异，改善灵敏度。 内源性mRNA的测定不需稳定感染细胞的传代，并作为基因检测的报告实例。 该技术可用于检测参考品和治疗产品效价，还可用于对更复杂材料（如血清）的诊断测定
7、（中和抗体）。 提高生物测定速度，如q-PCR法与传统理化测定技术共用，可以在线监测产品质量。,出访情况简介,访问时间：2009年5月37日 地点：渥太华，加拿大卫生部生物制品质量研究中心（Center for Biologics Research, CBR） 人员:王军志 叶强 李长贵 内容：参加“中加生物制品质量控制 研讨会”并访问CBR,参观CBR实验室,与批签发部门的交流,疫苗批签发由生物制品评价中心的实验室承担 批签发实行分级管理，根据生物制品的种类、风险性进行评估，将其分为四个等级，如新疫苗和活疫苗为最高等级，除资料审核外，还需进行关键项目的实验室检测，最低等级的制品只进行资料审核
8、。 分级管理是动态的,对CBR研究特色的体会,生物/化学/分离方法的有机结合对生物制品结构和功能的相关性研究 以各种高技术分析方法对生物制品质量进行深入研究 新检测方法的研究-新颖性、实用性 对生物制品前沿领域的把握,二. 高端理化方法用于生物制品 质量研究,1.生物/化学/分离方法结合分析糖蛋白,单克隆抗体在不同供氧浓度时，采用HPAEC-PAD（高pH阴离 子交换色谱和脉冲电流检测仪） 分析方法可以看到不同条件下 的单抗的结构差异,1.生物/化学/分离方法结合分析制品质量,单克隆抗体在不同供氧浓度时，采用FACE（荧光辅助糖电泳 ） 质谱分析方法可以看到不同条件下的单抗的结构差异,FACE
9、分析,MALDI-QqTOF-MS分析,2. 流感疫苗质量分析,应用NanoLC/MS方法分析同一企业三批流感疫苗的质量,红蓝绿代表三批制品,2.流感疫苗质量分析,应用NanoLC/MS方法分析三个企业流感疫苗的质量,3. EPO糖基化分析,EPO-,EPO-,不同企业的EPO通过毛细管电泳发现有不同的糖基化形态. 成品分析，能在高浓度保护剂存在时分析,3.EPO糖基化分析,4. NMR分析蛋白结构,NMR分析GM-CSF结构,NMR分析rIFN-a2a结构,正确折叠图谱,非正确折叠图谱,三, 新生物学活性测定方法的研究,国外已上市HPV疫苗,两种疫苗效力检测方法的比较(国外),效力检测方法的
10、比较(国内),实验室操作培训：体外相对效力检测方法 (IVRP),参加人员分为三组，每两人配合完成试验 按照NIBSC修订的SOP进行操作 数据分析 使用CombiStats对数据进行统计学分析 该软件由 European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare (EDQM)研发 免费测试版： http:/combistats.edqm.eu/site/combistats-635.html Merck 方法. NIBSC 认可,3. 干扰素效价测定新方法,1）传统抗病毒试验的缺点：时间长（4天）；变异系数CV值高（达50%）
11、；每次试验须对病毒进行滴定； 2) 以前研究报道过的方法特点：细胞系不太稳定（15代）；检测范围窄； 3）新近研究报道的方法特点：更加简便、快速及较小变异。,方法步骤,将干扰素激活反应元件（the Interferon Stimulation Response Element ，ISRE）插入人细胞系HEK293的染色体中. ISRE: 干扰素受体, 报告基因荧光素酶和嘌呤耐药基因 复制细胞，筛选出最佳的细胞系 进行干扰素效价测定验证试验,干扰素效价测定试验：简便&良好稳定性,步骤1 步骤2,将CBR细胞与IFN同时加入培养板后进行培养 溶解细胞&读数,CBR & McGill：按设计将干扰素
12、反应元件(interferon response element)整合入染色体中的细胞 仅两步：将细胞与IFN同时加入培养板中，18 hr后，溶解细胞加入荧光素酶底物,直接进行读数,3.新检测方法的研究 IFN活性新方法,将IFN刺激应答组件插入到人传代细胞中，并携带报告基因，筛选高拷贝插入序列和传代稳定的细胞株，用于IFN活性检测 检测时间缩短为1天，重复性、变异性好，操作简单,干扰素效价测定试验的特点,细胞具有良好稳定性，传至52代后无差异 1) P=0.3426, 0.05 (对3个不同代进行比较) 2) CV=5.02% (好于预期可接受的20-30%的范围) 基质（4批） 1) P=
13、0.08 or 0.05 2) CV=11.88% (好于 20-30%) 操作人（3个） 1) CV=9-11.43% (individual very good). 2) P=0.012, 3个操作人: 无差异. 特异性：线性反应中，IFN均不与其他细胞因子 (TNF, GM-CSF, IL-2, IL-4, etc.up to 15 cytokines tested)反应。 复制数：5 per cell (18株克隆中有1株合适) 样品来源：与产品标签相符合（人注射用） 检测范围： 0 3200 IU/mL （远大于其他报道过的方法） 不同天数：无差异（CV=5.6%）,新方法的优点:,
14、新方法较传统方法更加简便、快速、客观及具有更好稳定性。 对大量克隆细胞进行筛选与分析后，在18个子克隆中仅有1株适用于试验。 CBR试验优于以前报道研究过的试验体系：如细胞更加稳定(56 passage vs. 15 passages) ,检测范围更宽等。,干扰素测活新方法的研究(NICPBP),构建细胞株 293细胞中插入干扰素刺激 反应元件（ISRE ）用嘌呤 霉素稳定 实验步骤 铺板、加样 培养21h 加入Bright Glo luciferase reagent 读数,技术路线,干扰素测活新方法的研究,干扰素测活新方法的研究,前期实验结果,3.新检测方法的研究 百日咳残余毒素的研究,F
15、etuin,N3-glycan,Substrate,COLOUR,Anti-PT antibody,HRP-secondary antibody,HRP,*Gomez et al. 2006 Anal Biochem 356:244-253,PTx,pH 10.2,pH 10.2,pH 7.4,pH 7.4,百日咳毒素 (PTx),百日咳类毒素 (PTd),四. 替代定量方法研究,1, 流感病毒通用抗体,2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 (-) (+),Influenza HA subtypes,80 60 50 40 30,HA0,HA2,针对流感病毒血凝素的通用抗体,
16、1, 流感病毒通用抗体,2. 单核细胞活化试验简介,单核细胞活化试验(the monocyte activation test ，MAT)为一种检测药品中炎性因子及热原污染物质的体外试验新方法。 依单核细胞来源不同可将该方法大致分为以下三类: 人外周血单个核细胞（PBMNC）法 单核细胞系法（如THP-1、MM-6） 人全血法,MAT法基本原理,IL-6,热原物质刺激单核细胞(如人外周血单个核细胞，PBMNC )后,导致其形态改变并释放某些能致机体发热的蛋白进入血液。因该类蛋白可引起机体体温升高，又将其称为内致热原，其成分主要为各类细胞因子(如IL-6 、IL-1、TNF-等)。,MAT法基本原理,MAT法将热原物质、受试药品分别与单核细胞孵育，通过免疫化学分析法(如ELISA)检测与比较孵育体系中细胞因子的含量，反映药品中各类炎性因子及热原物质的污染情况。,MAT法主要特点,针对家兔热
