植物组织培养的基本原理1

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1、第二章 植物组织培养的基本原理,第一节 细胞全能性与细胞分化,一、细胞全能性理论的提出与发展： 植物细胞全能性理论是植物组织培养的核心理论。 1839年, Schwann提出有机体的每一个生活细胞在适宜的外部 环境条件下都有独立发育的潜能。 1901年, Morgan首次提出一个细胞应具有发育出一个完整植 株的能力。 1902年，Haberlandt 首次提出细胞培养的概念。,1934年, White用离体的番茄根建立了第一个活跃生长的无 性系，使根的离体培养实验首次获得了真正的成 功。提出B族维生素的重要性。 1944年，Skoog报道DNA的降解产物腺嘌呤, 可以促 进愈伤组织的生长，解除

2、生长素对芽形成的抑 制作用，诱导芽的形成。 1958年, Steward和Reinert由培养的胡萝卜细胞诱导形成了 胚状体。 1965年, 由Vasil和Hildebrandt用单个分离的细胞培养 获得整个植株, 植物细胞全能性的理论真正得到 了科学的证实。,二、细胞分化：,分化： 植物体各个部分出现异质性的现象。 细胞分化 是导致细胞形成不同结构、引起功能改变或潜在的发育方式改变的过程。 细胞分化 是基因在特定的时间和空间条件下选择性表达的结果。 一个活细胞从植物体内分离出来，脱离开原有的环境，其被抑制的功能将得以恢复，重新表现出全能性。,第二节 植物的脱分化,一、愈伤组织的形成 1、形成

3、条件： 外植体的细胞类型不同，形成的愈伤组织也常常异质。 离体培养条件对于愈伤组织的诱导至关重要。两个因素起主要作用：激素种类、浓度。此外，光照、基本培养基的选择、外植体的不同生育期等条件也很重要。 诱导愈伤组织产生的主要激素有：生长素和细胞分裂素类。 生长素类主要有：2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）, NAA（-萘乙酸），IBA（吲 哚-3-丁酸）、 IAA(吲哚-3-乙酸）等. 细胞分裂素类主要有： KT（6-呋喃甲基腺嘌呤，激动素）、6-BA（6-苄基腺嘌 呤）。,2、愈伤组织的来源、与起始材料的差异,1）来源： 薄壁细胞发生脱分化、次生分生组织（如维管形成层细胞）受到刺激或初生分生组

4、织（如苗端、根尖等）发育受到抑制而形成愈伤组织。 2）差异： 有些愈伤组织可以保持其母体植株和器官的某些特性。 但大多数研究报道，愈伤组织和起始材料之间明显的差异。原因： a. 组织培养的细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构等，这些都是与获得外植体的起始器官有差别。 b. 影响酯酶同工酶 、脂肪 、生物碱 、蛋白质组分 、叶绿素的合成。,3、脱分化的作用机理,静止细胞不表现分裂状态，是受到某种物质的抑制，去掉这种抑制物质后，就可以恢复到分裂状态。 用阻碍细胞分裂的物质，氟化去氧尿核苷（FUDR）处理细胞，能阻止细胞分裂，它通过抑制胸腺嘧啶核苷三磷酸（TTP）的形成来阻碍DNA的复制。 细胞中

5、有天然抑制细胞分裂的物质存在，经植物生长调节剂的诱导，可以解除抑制作用而出现细胞分裂。 生长调节剂对核仁的作用很明显。核仁是外加生长素的作用场所。 用14C标记2,4-D发现主要积累在细胞的核仁中。在细胞核中，存在着某些与核仁结合的抑制物质，这种抑制物质可在生长调节物质的作用下，失去其抑制效应，表现出DNA的复制、转录、表达、最后发生分裂。,4、愈伤组织形成过程：,诱导期（启动期）：细胞准备分裂的时期。 外植体细胞在适宜的诱导培养条件下，细胞中RNA含量迅速增加，核糖体数量增加、淀粉消失、线粒体嵴膜数量增多，细胞内合成代谢迅速加强。但此时外植体的体积大小改变不大。,(2) 分裂期：细胞迅速分裂

6、时期 外植体外层细胞开始迅速分裂，中央细胞常不分裂，由于分裂不均匀，形成了中间静止的芯。 细胞分裂快，结构松散、颜色浅、透明。 细胞质变浓，核仁和核增大，液泡变小，RNA含量增高，表明合成和代谢旺盛进行。 细胞逐渐回复到分生状态，这一过程称为回复变化。即脱分化。细胞数目增加迅速，出现小的愈伤组织。 分裂期要经常更换培养基来保持其增殖但不分化的状态，这种培养叫做继代培养，使用的培养基叫做继代培养基。,分裂期,(3)分化期. 细胞体积大小稳定、细胞由平周分裂转为垂周分裂。 在分化末期，细胞的形态和结构上出现形态、功能不同的区域。,5、 愈伤组织的生长过程的特点：,1）体积、重量： 2）生理生化特性

7、： 诱导期、分裂期的细胞中RNA含量增加迅速、分化期含量减少。 培养条件的改变影响了某些物质的合成。 继代培养时间的加长，愈伤组织可能出现“驯化现象”。即在没有生长素的培养基上也能生长一段时间。,松散型,致密型,3）质地： 愈伤组织的质地分为：松散、致密两类。在适宜的条件下可以相互转化。,第三节 细胞的再分化,一、不同水平上发生的再分化： 细胞水平：细胞壁增厚，假导管组织形成、各种酶活性发生变化，形成不同类型的细胞。 组织水平：维管组织发生的分化。愈伤组织中形成的维管组织，与正常植物的维管系统不同，是一些呈分散的节状或短束状结构。 器官水平：也叫做器官发生。 器官型（organ type）直接

8、由外植体细胞形成器官原基，然后发育为器官。 器官发生型（organogenesis type）是由外植体形成愈伤组织后，由愈伤组织再产生不同的器官原基。,二、植株再生的方式：,1、器官发生（organogenesis）： 一部分由外植体中已存在的器官原基发育而来。 多数则是由外植体经过脱分化后形成愈伤组织，在不断的培养过程中形成的一些分生细胞团，这些分生细胞团在进行分化后，重新形成不同类型的器官原基形成的。 特点：单极性结构、新发生的器官原基中的原形成层结构与母体（愈伤组织或外植体）的维管组织相连接。,通过器官发生形成再生植物通常有三种方式： 先生根，再长芽。 先产生芽，再生根。 愈伤组织不同

9、部位形成根、芽，通过维管组织将根、芽连结在一起。,2、体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis）： 特点：双极性结构，由单个体细胞形成胚状体，最后发育生长为一个植株。,三、极性与细胞的不均等分裂在分化中作用,极性: 在植物的器官、组织、细胞中，在不同的轴向上存在的某种形态结构和生理生化上的差异。 1、极性的表现 合子有高度的极性.,合子经过短期的休眠后进行不均等分裂，产生一个较大的基细胞(basal cell)和一个较小的顶端细胞(apical cell)。 顶端细胞经若干次分裂后形成原胚，再依次经过球形期、心形期、鱼雷形期和成熟期最终成为成熟胚.,在分裂初期，生殖细胞和营养

10、细胞的细胞质中，细胞器没有差异。 小孢子分裂的末期产生的成膜体，形成一个细胞板，随后，变为分隔营养细胞和生殖细胞的壁。由于胞质分裂高度的不均等性，形成大小悬殊的营养细胞和生殖细胞。,小孢子有丝分裂形成两个细胞，一个是营养细胞，一个是生殖细胞。,茎切段有极性。 2、作用： 使细胞内生活物质的定向和定位，表现两极分化，导致两极不对称性。 3、决定因素： 微管结构决定细胞分裂的取向，决定着细胞最终的形态。 质膜作为接受外界刺激的最初反应部位，其局部变化及其与微丝的结合可能是极性形成并稳定的基础。,微管的结构 微管(microtubule)是存在于细胞质中的由微管蛋白(tubulin)组装成的中空管状

11、结构。, A.微管。左为整体观(部分)；右为横剖面，示13条原纤丝，、为微管蛋白,微管的主要结构成分是由-微管蛋白与-微管蛋白构成的异二聚体，这些微管蛋白组成念珠状的原纤丝，由13条原纤丝按行定向平行排列则组成微管。 管壁上生有突起，通过这些突起(或桥)使微管相互联系，或与质膜、核膜、内质网等相连,细胞骨架的作用: 维持细胞形态、保持细胞内部结构的有序性 与细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递、细胞分裂、基因表达、细胞分化等生命活动密切相关。 现代细胞生物学把细胞骨架系统和细胞的生物膜系统、遗 传物质系统并列为细胞的三大系统。,第四节 植物体细胞胚的发生,一、概念：,1、胚胎发生: 胚的发育

12、过程。,2、体细胞胚胎（somatic embryo）或胚状体（embryoid)，简称体胚。,在植物组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生、发育过程形成双极性的胚状结构。,含义： 不同于合子胚，它不是两性细胞融合的产物； 不同于孤雌胚或孤雄胚，它不是无融合生殖的产物； 不同于组培中器官发生途径形成的茎芽和根； 它是一个与合子胚的发育过程相似、具有双极性的胚状结构。,特点：,1、双极性： 细胞质、细胞核偏移、细胞器区域化分布，细胞出现极性。 2、生理隔离： 单个体细胞胚胎细胞常处于孤立状态，即与周围的细胞缺少联系，初期有时还能看到胞间连丝，后期则细胞壁加厚，细胞与细胞间分离。与外植体的维

13、管束无直接联系。,二、体细胞胚的发生过程：,胚性愈伤组织诱导； 体胚诱导； 体胚早期分化发育； 体胚成熟； 体胚再生。,Comparison of moncot and dicot and gymnosperm somatic embryos A. Somatic embryo of orchardgrass growing from an embryogenic callus: coleoptile and notch B. Somatic embryo of grape growing from an embryogenic callus: two flattened cotyledons

14、 and subtending hypocotyl C. Somatic embryo of Norway spruce: multiple cotyledons and elongated hypocotyl.,胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织的区别：,形态与结构：胚性愈伤组织（embryogenic callus）外表松散、颗粒状，细胞核大、细胞质浓； 生理生化：DNA、RNA、蛋白质合成加强；淀粉、可溶性糖等增加；内源激素合成变化大。,三、胚状体发生的方式：,体细胞胚胎发生的方式有直接、间接两种： 从培养中的器官、组织、细胞或原生质体直接分化成胚， 中间不经过愈伤组织阶段。 外植体首先发生脱

15、分化，然后由愈伤组织细胞分化为胚。 后者较为常见。 间接发生方式一般要有胚胎发生丛（Embryogenic dump，EC）与胚状体发育两个过程。 EC是指细胞质浓、体积小常常聚集丛生、且高度分化的一些愈伤组织细胞。,小麦幼胚愈伤组织诱导,四、体胚发生的机理：,拟南芥、水稻、胡萝卜等模式植物体细胞胚胎发生的研究。 体细胞胚的起源一般认为由单细胞形成。在离体条件下，受到抑制的基因得到表达，表现出细胞全能性。 在体胚发生的过程中，一些与基因表达过程有关的大分子物质发生很大的变化。 胚性与非胚性的愈伤组织中的基因表达存在着一些差异。某些特殊基因在胚性愈伤组织中得到表达。如细胞周期调节基因cdc2(c

16、ell division cycle 2)、LEC 1、2（leafy cotyledon 1、2）的表达也与胚状体的形成有密切的关系。另外，在体胚发育的后期产生大量的晚期胚胎发生丰富蛋白（late-embryogenesis-abundant protein, LEA 蛋白）。,五、体胚发生的生理生化变化：,1、蛋白质与核酸 可溶性蛋白质含量较高，并且在球型胚时期含量最高。 核酸：胚性细胞中的DNA与RNA合成速率增加。体胚发生的分 子基础。 2、多胺代谢 多胺（polyamines, PAs)是一类脂肪族含氮碱。细胞分裂旺盛的地方含量较高。 常与核酸结合，参与DNARNA蛋白质的合成。在体胚中发现多胺合成酶活性提高、多胺含量增加。 3、糖类 提供碳源、维持渗透压以及信号分子的作用。 体细胞胚中淀粉合成和积累达到较高的水平。它为体胚的发 育提供了良好的能量和物质基础。,4、金属离子： 乙烯的产生会抑制体胚的发生。与乙烯产生有关的离子与体胚的产生也有密切的关系。Ag+、Co2+、Ni2+可提高体胚的发生。,