外源目的基因表达与调控

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1、第六章 外源目的基因表达与调控,生物体的遗传信息都是以核苷酸序列编码的形式储存在遗传物质DNA上, 基因表达是目的基因DNA在导入的细胞内转录成mRNA, 再以mRNA指导翻译成蛋白质。基因的表达依赖于有效的转录和mRNA的正确翻译以及翻译后的加工处理等各个环节的调节作用，其中转录最为关键，原核的基因表达过程和方式与真核细胞有显著不同。,外源基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个重要环节。 基因的转录是在RNA聚合酶的作用下合成mRNA，原核生物mRNA一般不需要转录后加工。 真核生物mRNA在细胞内合成，且需要经过一繁殖加工过程：RNA剪接、5端加帽、 3端加上poly(A)尾巴。 原核生

2、物一般没有翻译后加工，真核生物有较复杂的翻译后加工。,第一节 外源基因表达机制,一、外源基因的起始转录 外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。 理想的可调控的启动子在细胞生长的初期不表达或低水平表达，当细胞增殖达到一定的密度后，在某种特定诱导因子的诱导下，RNA聚合酶开始启动转录，合成mRNA。,二、mRNA的延伸与稳定性 外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。 为了防止mRNA在转录过程中的非特异性终止，可以在构建表达载体时加入抗终止的序列元件。 在表达载体中加入正常转录终

3、止序列，可以防止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，增加外源基因表达的稳定性。,三、外源基因mRNA的有效翻译 外源基因在原核生物中的有效翻译需要考虑： 1. AUG(ATG)是首选的密码子； 2. SD序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基； 3. SD序列与翻译起始密码子之间的距离为39个碱基； 4. 在翻译起始区的周围的序列不易形成明显的二级结构。,真核细胞mRNA的5非翻译区不存在SD序列，但绝大多数mRNA的起始序列含有共同序列。 不同生物使用密码子具有不同的偏好性。如果外源基因的mRNA密码子使用受体的偏好密码

4、子，则表达效率高。 mRNA上的终止密码对正确翻译的效率有很大影响。在原核细胞中，UAA为最常用的终止密码子。,四、表达蛋白质在细胞中的稳定性 外源基因的表达产物在宿主细胞中的稳定积累，不被宿主蛋白酶所降解，可有效提高表达量。 避免外源蛋白被宿主蛋白酶降解的措施: 1.构建融合蛋白表达系统。 2.构建分泌蛋白表达系统。 3.构建包涵体表达系统。 4.选择蛋白酶缺陷型的受体系统。,五、基因沉默 基因沉默是导致外源基因不能正常表达的重要因素，主要出现在转基因动物和转基因植物中。 目的基因沉默是在核酸水平上DNA与DNA、DNA与RNA、RNA与RNA相互作用的结果。重复序列或同源序列是基因沉默的普

5、遍原因之一，在构建表达载体时，应尽可能避免与内源序列有较高的同源性。,第二节 基因表达的调控元件,一、启动子 启动子是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，一般位于表达基因的上游。 1.序列特异性。在启动子的DNA序列中，通常含有几个保守的序列框。 2.方向性。启动子是一种有方向性的顺式调控元件。 3.位置特性。一般启动子只能启动其下游基因的转录。 4.种属特异性。,二、增强子 增强子是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列。 1.双向性。正反两个方向调节活性。 2.重复序列。增强子一般含有能独立行使功能的重复序列。 3.功能与位置无关。 4.特异性。组织特异性，或在特定细胞阶段。

6、5.对异源基因也有调节功能。,三、终止子 终止子是提供终止信号使RNA聚合酶停止转录的DNA序列。 本征终止子指不需要其他蛋白辅助因子便可在特殊的RNA结构区内实现终止作用。属于强终止子。 依赖型终止子需要因子的辅助，属于弱终止子。,四、衰减子 衰减子是基因表达调控的精细调节装置，利用原核生物转录与翻译相偶联的特性，依赖自身巧妙的特征序列和相应的RNA二级结构，对基因转录进行地开关式的微调作用，从而保证原核生物在相关操纵子处于阻遏的状态下仍能以一个本底水平合成氨基酸、核苷酸和抗生素等。,五、绝缘子 绝缘子长约几百个核苷酸，是通常位于启动子同正调控元件(增强子)或负调控因子之间的一种调控序列。绝

7、缘子本身对基因的表达既没有正效应，也没有负效应，其作用只是不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用。,六、反义子 反义RNA是一类与特定DNA序列互补的小分子RNA。编码反义RNA的DNA称为反义子。反义RNA广泛存在于原核生物和真核生物中，在DNA的复制、转录和翻译三个水平对基因的表达起着调节作用，其中以对蛋白质合成的抑制最普遍。,第三节 外源基因表达与调控,外源基因表达包括目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物(目的蛋白)。 外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。,外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 启动子 终止子

8、核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数,转录,翻译,一、大肠杆菌表达系统,R,35,10,SD,编码序列,Ori,Tcr,TT,启动子,起始密码子 AUG、GUG、UUG,终止密码子 UAAU、UGA、UAG,大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体，含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有关序列组成的能在大肠杆菌中有效复制的复制子。,(一)大肠杆菌基因表达载体,核糖体结合位点,启动子,转录终止子,复制 起点,1. 复制子是一段包含复制子起始位点和反式因子靶序列在内的DNA片段。 大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体，含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有关序列组成的能在大肠杆菌中有

9、效复制的复制子。,2.启动子和终止子 启动子是调控外源基因转录的重要顺式元件。理想的启动子应该具备以下性质： 第一, 必须是强启动子，能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上 第二, 这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件 第三, 这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。,外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即 RNA 聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA 序列，形成长短不一的 mRNA 混合物过长转录物的

10、产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子 mRNA 所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或 DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则 RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的 mRNA 往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构， 从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。,终止子,强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌 rRNA

11、操纵子上 的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌体 DNA 上的 Tf。 对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特 殊结构，以增强其转录终止作用,3.核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频 率，而且在很大程度上还与 mRNA 的翻译起始效率密切相关。 大肠杆菌细胞中结构不同的 mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。 mRNA 翻译的起始效率主要由其 5 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）。,大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的 68 个核苷酸序列 5 UAAGGA

12、GG 3 即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚 基中的 16S rRNA 3 端区域 3 AUUCCUCC 5 并与之专一性结合 将mRNA 定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以 AUG作为阅读框架的 起始位点，有些基因也使用 GUG 或 UUG 作为翻译起始密码子 SD 序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 基因编码区 5 端若干密码子的碱基序列,4.密码子 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。外源基因在大肠杆菌中的表达需考虑密码子的偏好性。 5.选择标记 大肠

13、杆菌的选择标记一般采用抗生素抗性基因。,(二)宿主菌 外源基因表达产物在大肠杆菌细胞内容易被降解，为了避免降解，需要构建与表达载体相适应的大肠杆菌宿主菌。如BL21。,（三）常见的大肠杆菌表达系统 目前应用广泛的大肠杆菌表达系统主要有Lac和Tac表达系统，PL和PR表达系统，T7表达系统。 Lac和Tac表达系统是以lac操纵子调控机制为基础构建的表达系统。,P tac = 3 P trp = 11 P lac,启动子,转录调控机理 具有多顺反子结构，基因排列次序为： 启动子（lacP）- 操纵基因（lacO） - 结构基因（lacZ-lacY-lacA） 正调节因子 CAP 负调节因子 l

14、ac I,Lac 表达系统 以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统,lacI Plac lacO lacZ lacY lacA,lacI Plac lacO lacZ lacY lacA,Lac 表达系统 正调节因子 CAP cAMP激活CAP，CAPcAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合 后，能促进 RNA 聚合酶与 35、10 序列的结合，进而促进 Plac 介导的转录。,基因工程中使用的 lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即 Plac UV5,Lac 表达系统 lac UV5 突变体 Plac UV5 突变体能够在没有 CAP 存在的情形下非常有效

15、的起始 转录，受它控制的基因在转录水平上只受 lacI 的调控，因此用它 构建的表达载体在使用时比野生型 Plac 更易操作。,Lac 表达系统 负调节因子 lac I 在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动 子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。,lacI Plac lacO lacZ lacY lacA,lacI Plac lacO lacZ lacY lacA,Tac 表达系统 tac 启动子是由 trp 的 35 序列和 lacUV5 的 10 序列拼接而成的杂 合启动子。 调控模式与 lacUV5 相似，但 mRNA 转录水平高于 trp 和 lacUV

16、5 启动子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有较高基因表达 水平的情况下，选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越。,lac、tac 启动子对宿主菌的要求 在普通大肠杆菌中， LacI 阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上 lac 操纵子 转录调控的需要。 当多拷贝的 lacO 随着带有 lacUV5、tac 启动子的表达质粒转化进入 大肠杆菌后，LacI 阻遏蛋白与 lacO 的比例显著下降，无法保证每一 个 lacO 都能获得足够的 LacI 阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱 导物存在的情形下， lacUV5、tac 启动子有较高的本底转录。,lac、tac 启动子对宿主菌的要求 为了使以 Lac、Tac