发酵工程-2012-生物科学1

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1、第四章 发 酵 工 程,细胞工程,酶工程,发酵工程,基因工程,发酵工程是一个历史悠久的行业，与人类生活和健康息息相关。 日常的发酵产品？ 发酵工程的定义？,1 发酵工程概论 1.1 发酵的概念 1.1.1 传统意义上的“发酵”概念 用来描述“酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡”的现象。,1.1.2 生物化学和生理学意义的“发酵”概念,指微生物在无氧条件下，分解各种有机物，产生能量的一种方式。 如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2,1.1.3 工业意义上的“发酵”概念 泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程，包括： （1）厌氧发酵的生产过程，如酒精，乳酸等。 （2）好氧（通气）发酵

2、的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。 1.1.4 现代“发酵” 泛指“利用生物细胞（应用生物技术获得的细胞）生产某种产物的过程又称新型发酵。,发酵工程： 亦称（微）生物工程，是大规模发酵生产工艺的总称，就是利用生物细胞的生命活动，通过现代工程技术手段来生产有用物质的技术。,1.2 发酵工程的主要发展阶段 1.2.1 天然发酵阶段：传统的酿酒、制酱等。 1.2.2 纯培养阶段：人工控制微生物发酵过程 （第一个转折点） 1.2.3 通气搅拌技术阶段：（第二个转折点） 1.2.4 代谢控制发酵技术阶段：（第三个转折点） 1.2.5 利用基因工程菌进行发酵阶段：（第四个转折点）,1.3 发酵工程技

3、术的应用 1.3.1 医药工业 抗生素、维生素、酶、疫苗、干扰素等 1.3.2 食品工业 SCP、氨基酸、饮料、酒类、添加剂等 1.3.3 能源工业 纤维素、半纤维素的转化、采油、产氢、沼气的生产等。,1.3.4 化学工业 乙醇、丙酮、生物塑料、表面活性剂等。 1.3.5 冶金工业 黄金开采和铜、铀等金属的浸提等。 1.3.6 农业、牧业 生物固氮、生物杀虫剂、微生物农药、微生物饲料等。 1.3.7 环境保护 有机废物（生活垃圾）的微生物的降解。,以上这些应用可概括为五个方面的内容： 1、微生物菌体发酵 2、微生物酶发酵 3、微生物代谢产物发酵 4、微生物的转化发酵 5、生物工程细胞发酵：指“

4、应用生物技术获得的细胞进行培养的新型发酵”（动、植物细胞、杂交瘤细胞等的培养）。 这些内容都通过以下两大发酵类型来实现。,在开放或密闭的发酵设备中完成。,发酵技术的特点： 速度快； 条件人工可控； 原料可再生（易得）； 产物分子复杂； 易染菌；,2 发酵过程及控制 2.1 发酵一般过程,生产者,原料,场所,产品,生物细胞,培养基,发酵罐,产品,发酵罐 (发酵条件控制),发酵工程的一般过程,2.2 微生物及菌种 微生物广泛地存在于自然界中，与人们生活紧密相关，有的有害，有的有益。如 2.2.1 工业生产常用微生物 细菌：醋酸、丙酮、丁醇、乳酸以及氨基酸、酶、维生素、酸菜、酸奶； 霉菌：酶制剂（制

5、曲）、制药、饲料； 酵母菌：单细胞蛋白、酒精生产（酿酒）、疫苗；,注意： 因类、种不同而有不同的生理生化特性。,2.2.1.1 细菌类 （1）枯草芽孢杆菌 （2）大肠杆菌 （3）醋酸杆菌 （4）棒状杆菌 （5）短杆菌（产氨短杆菌）,球菌,杆菌,2.2.1.2、霉菌类 （1） 黑曲霉 （2） 米曲霉 （3） 青 霉 （4） 木 霉 （5） 根 霉 （6） 毛 霉,黑曲霉的电镜观察图像,黑曲霉平板生长菌落图像,米曲霉电镜观察图像,米曲霉平板培养菌落图,青霉,木霉,根霉,毛霉,毛霉在PDA培养基上的菌落特征,2.2.1.3 放线菌类 （1）链霉菌属 （2）诺卡氏菌属,链霉菌属,诺卡氏菌,2.2.1.

6、4 酵母类 （1）啤酒酵母 第一个完成全基因组序列测定的真核生物（1997）； （2）假丝酵母,酿酒酵母,2.2.2 工业化生产对菌种的要求： (1)能利用廉价原料，产物产率高； (2)条件易掌握和控制； (3)速度快； (4)满足代谢调控要求； (5)抗噬菌体的能力强； (6)优良性能持久、稳定； (7)非病源菌；,获得生产用微生物菌种的一般过程:,原菌种,斜面试管,液体试管 或三角瓶,一级种子罐,二级种子罐,发酵罐,接种：可采用菌体或孢子 对于细菌、酵母，常采用菌体接种； 对于霉菌、放线菌，常采用孢子接种；包括孢子悬浮液的制备,2.2.3 种子扩大培养过程及控制 2.2.3.1 工艺过程,

7、（1）培养基成分 A、因孢子和菌丝体不同而异； B、最后一级种子培养基应尽量与发酵培养基一致； C、配比恰当、新鲜； （2）种龄与种量：对数期、1%-10%； （3）培养条件：温度、 pH值、溶解氧； （4）泡沫：泡沫影响氧溶解和传递； （5）染菌：染菌影响（纯、壮、量）； （6）种子罐级数：与“菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度、罐的容积”有关。,2.3 培养基及其制备 生物体主要由：C、H、O、N 四种元素组成。 发酵培养基的组成和配比，因微生物种类、设备、工艺、原料来源及质量不同而有所差别 碳源： 碳源是组成培养基的主要成分之一（菌体干物质的50%以上是碳）。 主要功能：细胞、产物的骨

8、架； 来源：糖类；,氮源 氮源也是培养基的主要成分之一（占干物质量的10%）。 主要功能：细胞、酶产物的组成； 来源：有机氮、无机氮；,无机盐及微量元素 主要功能：组成、辅助因子等；来源：盐（原料、水）； 特殊生长因子 不可缺、量微，自身不能合成或量不够。 主要功能：辅酶，电子受体； 来源： 水 水是物质溶解和生化反应的基础。 功能：,2.4 发酵及控制 2.4.1 发酵类型,无论耗氧发酵还是厌氧发酵，都需要在反应器中完成。,比较一下各自的有缺点,2.4.2 生物反应器(Bioreactor) 2.4.2.1 发酵罐的基本条件 适宜D/H； 承载一定的压力； 充分混合(好氧)； 密封严，无泄漏

9、； 结构要经济；,2.4.2.2 液态厌氧发酵设备 有冷却装置 没有通风装置 代表： （1）酒精发酵罐 （2）啤酒发酵罐,2.4.2.3 液态好氧发酵罐 有冷却装置； 有通风装置； 代表： 机械搅拌发酵罐 气体搅拌发酵罐,机械搅拌发酵罐,（2）气体搅拌发酵罐 内循环 外循环,2.4.3 发酵的操作方式,2.4.3.1 间歇发酵法 一次性；不稳定； 过程，营养不断减少，微生物不断增殖，环境呈不稳定状态。 微生物生长的四个时期明显。 应用广泛,分批培养微生物群体的生长,1.延滞期 2.对数期 3.稳定期 4.衰亡期,2.4.3.2 连续发酵法 等量流入流出； 各种变化0； 微生物群体生长的四个时期

10、不完整； 常用于废水处理、葡萄糖酸、酒精、氨基酸发酵等工业中；,1,2,3,4,5,6,7,糖化醪 + 酒母,多级连续发酵系统,连续发酵的优点： 操作稳定； 利于机械、自动化； 提高设备的利用率； 减少灭菌次数； 易于过程优化； 连续发酵的缺点： 易染菌； 微生物易变异； 对产品类型的适应性不广； 对设备及附件要求高；,2.4.3.3 补料间歇发酵法 在分批培养时，连续地供给培养基到一定程度的方法，称为补料分批培养法。 用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工业。 补料间歇发酵的特点： 可以解除底物抑制、产物抑制、G分解阻遏或克服微生物过度生长等；,2.4.4 发酵工艺控制,2.4.4.1 温度的控制

11、 (1)影响发酵温度的因素 培养基氧化、机械搅拌等产生一定的热量、罐壁散热、水分蒸发带走部分热量。,温度变化具有时间性；,(2)为什么要控制温度： 影响产物生成速度 影响发酵液性质 影响产物种类 a.改变酶系中间产物种类产物种类; b.使代谢比例失调； 影响产物特性 (3)控制方式： 冷媒（喷淋、蛇管、夹套）,2.4.4.2 pH的控制 （1）控制pH的意义 不同种类微生物，对pH要求不同； 同种微生物对pH变化的反应不同。 pH不同，微生物代谢产物不同。 微生物生长和发酵的最适宜pH可能不同。,(2)引起发酵pH变化的因素 下降 培养基中C/N太高，有机酸积累； 消沫油加得过多； 生理酸性物

12、质过多； 上升 C/N比例太低，N过多，氨基氮释放； 生理碱性物质过多； 中间补料时碱性物加入量过大；,（3）控制pH的方法 A、常见方法 调整生理碱性和酸性盐类的比例； 选择不同C、N的种类和比例； 添加缓冲剂； 流加酸或碱； B、应急措施 改变搅拌转速或通气量，以改变溶解氧浓度，控制有机酸的积累量及其代谢速度； 改变温度，以控制微生物代谢速度； 改变罐压及通气量，降低CO2的溶解量； 改变加油或加糖量等，调节有机酸的积累量；,2.4.4.3 溶解氧,（1）影响氧溶解的因素 温度； 微生物需氧量（耗氧速率，本质）； 氧溶解的推动力； （2）控制溶解氧的意义 （ 多数发酵产品的生产是好氧发酵；

13、 培养基中的氧不足以维持发酵过程； 不同微生物或同一微生物的不同生长阶段对氧的要求也不相同；） 节约能量,在发酵工业中，氧主要通过通入无菌空气的方式来供给。 通气量与菌种、培养基性质、培养阶段有关。 通气量的大小，最好由氧溶解量的多少来决定。而氧溶解量的多少与多种因素有关。,（3）提高溶解氧的方法 增加氧溶解的推动力 增加通气量、提高氧分压； 延长氧的停留时间： 提高搅拌转速、搅拌器形式；,3、典型产品的发酵生产 3.1 谷氨基酸发酵 AA是构成蛋白成分； 目前世界上可用发酵法生产氨基酸有20多种。,氨基酸的用途 (1)食品工业： 强化食品：(赖氨酸，苏氨酸，色氨酸) 增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬

14、氨酸 甜味剂：苯丙氨酸与天冬氨酸生成低热量二肽 (-天冬酰苯丙氨酸甲酯) 。,(2) 饲料工业： 甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料 (3) 医药工业： 多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调 ； 苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效，且副作用低。 (4) 化学工业： 谷氨基钠作洗涤剂，丙氨酸制造丙氨酸纤维。,3.1.1 生产菌株 棒状杆菌、短杆菌、小杆菌（B9、AS1.542、AS1.299）、 T613(天津) 、7338 (北京) ，都是需氧型细菌； 野生菌株发酵； 营养缺陷型突变发酵； 抗AA结构类似物突变株发酵； 抗AA结构类似物突变株的营养缺陷型菌

15、株发； 营养缺陷型回复突变株发酵；,3.1.2 培养基 各级培养基要求不同，总原则：逐渐趋于工业化原料。,我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿棒杆菌和北京棒杆菌及各种诱变株。 生长特点：适用于糖质原料，需氧，以生物素为生长因子。 各级种子基本要素相同，但原料不同； （1）斜面培养： 蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成的pH7.0-7.2琼脂培养基，32培养18-24h。,（2）一级种子培养： 由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH6.5-6.8。1000ml装200-250ml振荡，32 培养12h。 （3）二级种子培养： 用种子罐培养，料液量为发酵罐投料体积的1，用水解糖

16、代替葡萄糖，于32 进行通气搅拌7-10h。 种子质量要求：二级种子培养结束时，无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数为108-109 /ml。 （4）发酵 水解糖液(或糖蜜) + 尿素 + 玉米浆,3.1.3 发酵工艺控制 （1）适应期：pH上升（尿素分解出氨使），糖不利用。2-4h。 措施：接种量和发酵条件控制使期缩短。 （2）对数生长期：糖耗快， pH又迅速下降(因氨被利用)。溶氧急剧下降后维持在一定水平。菌体浓度迅速增大，菌体形态为排列整齐的八字形。不产酸。12h。 措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH，在pH7.5-8.0时流加尿素；维持温度30- 32,两个耗糖高速期 ：,1.延滞期 2.对数期 3.稳定期 4.衰亡期,耗糖高速期,耗糖高速期,（3）菌体生长停止期：谷氨酸合成。 措施：流加氨（提供氮、维持pH在7.2-7.