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1、重组DNA技术简介,三、基本过程,二、基本条件,一、基本概念和原理,四、具体事例,D 基因工程的基本形式,1 基因工程的基本概念,C 重组DNA技术与基因工程的基本用途,B 基因工程的基本定义,A 重组DNA技术的基本定义,A 重组DNA技术的基本定义,1 基因工程的基本概念,重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。,B 基因工程的基本定义,1 基因工程的基本概念,基因工程是指重组DNA技
2、术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。,C 重组DNA技术与基因工程的基本用途,1 基因工程的基本概念,分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源,大规模生产生物活性物质,设计、构建生物的新性状甚至新物种,大规模生产生物活性物质,工程细胞,基因工程 蛋白质工程 途径工程,发酵工程 细胞工程,分离工程,酶,酶工程,分 离 工 程,天然细胞,天然细胞,生物活性物质,D 基因工程的基本形式,1 基因工程的基本概念,第一代基因工程 蛋白多肽基因
3、的高效表达 经典基因工程,第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程,第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程,第四代基因工程 基因组或染色体的转移 基因组工程,D 基因工程的支撑技术,2 基因工程的基本原理,C 基因工程的基本原理,B 基因的分子生物学,A 重组DNA技术的理论基础,A 重组DNA技术的理论基础,2 基因工程的基本原理,19世纪中 孟德尔 豌豆杂交试验 遗传因子 经典遗传学,20世纪初 摩尔根 果蝇杂交实验 基因 基因学,1944年 艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验 遗传物质DNA,1973年 伯格-杰克森-考恩-鲍耶 DNA分子体外拼接,分子遗传学,1953年 沃
4、森-克瑞克 DNA双螺旋结构 分子生物学,基因工程,B 基因的分子生物学,2 基因工程的基本原理,C 基因工程的基本原理,2 基因工程的基本原理,提高外源基因的剂量分子遗传学原理,筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如：启动子、,增强子、操作子、终止子、上游调控序列等,列、mRNA非编码区、密码子等,分子生物学原理,修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：SD序,基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产,生化工程学原理,分子生物学原理,D 基因工程的支撑技术,2 基因工程的基本原理,核酸凝胶电泳技术,核酸分子杂交技术,细菌转化转染技术,DNA序列分析技术,寡核苷酸合成技术,基因定点突变技
5、术,聚合酶链反应（PCR）技术,A 用于核酸操作的工具酶,3 基因工程的基本条件,限制性核酸内切酶,DNA连接酶,DNA聚合酶,核酸酶,核酸修饰酶,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的发现及其生物功能,识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链,主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵,细菌的限制与修饰作用,hsd R：编码限制性核酸内切酶,hsd M：编码限制性甲基化酶,hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达,1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出,Hind II和Hind III,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的类型,主要特性 I 型 II 型
6、III 型,蛋白结构,异源三聚体,同源二聚体,异源二聚体,切割位点,距识别序列1kb处,识别序列内或附近,距识别序列下游,随机性切割,特异性切割,24-26bp处,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的命名,属名 种名 株名,H i n d III H i n d III,Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株,同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶,II 型限制性核酸内切酶的基本特性,识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列,大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧,识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构,5 G C T G A A T T
7、 C G A G 3,3 C G A C T T A A G C T C 5,EcoR I的识别序列,EcoR I的切割位点,EcoRI等产生的5粘性末端,EcoRI 37 ,退火 4-7 ,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PstI等产生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,PstI 37 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C
8、-T-C 5,退火 4-7 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PvuII等产生的平头末端,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,PvuII 37 ,限制性核酸内切酶,II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：,Tris-HCl,50 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,NaCl,0 - 150 mM,DTT,1 mM,0 - 50 mM 低盐酶,100 mM 中盐酶,150
9、 mM 高盐酶,Volume,20 - 100 ml,T T,37 1 - 1.5 hr,1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全,水解 1 mg 标准DNA所需的酶量,限制性核酸内切酶,II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：,对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：,5 GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT3,3 CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5,BamHI SmaI,5 GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT3,3 CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA5,5 GC
10、TACATGGATCCC GGGTTCGCAT3,3 CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA5,限制性核酸内切酶,II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：,对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：,使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解,低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切,一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切,0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4,2.5倍体积的冰冷乙醇,冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥,限制性核酸内切酶,影响限制性核酸内切酶活性的因素,DNA样品的纯度：,蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、
11、NaCl等,加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶,加大反应总体积,延长反应时间,限制性核酸内切酶,影响限制性核酸内切酶活性的因素,DNA样品的甲基化程度：,大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位,引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、,Bgl II、Sau3A I不受影响,大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列,中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等,哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基,限制性核酸内切酶,影响限制性核酸内切酶活性的因素,核酸内切酶的缓冲液性质：,高浓度的酶、
12、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，,会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即,所谓的Star activity现象,EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘,油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5PuPuATPyPy3或者,5AATT3,DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键,DNA连接酶,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-
13、C 5,nick,nick,DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键,T4-DNA连接酶,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5,OH,P,nick,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5,DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,连接多个平头双链DNA分子：,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,T4-DNA连接酶,DNA连接酶,DNA
14、连接酶的反应条件,Tris-HCl,50 - 100 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,ATP,0.5 - 1 mM,DTT,5 mM,Volume,10 - 20 ml,T T,4 - 15 4 - 16 hr,1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1 小时，,完全连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量,DNA连接酶,平头双链DNA片段的连接操作,从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多 提高平头末端连接效率的方法包括：,加大连接酶用量（10
15、倍大于粘性末端的连接）,加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会,加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用,加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM,DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）,53的DNA聚合酶活性,53的核酸外切酶活性,35的核酸外切酶活性,大肠杆菌DNA聚合酶 I的基本性质：,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-OH,5 ppp dN Mg2+,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH,DNA pol I,D
