《《cr技术极其应用》ppt课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《cr技术极其应用》ppt课件（93页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、PCR技术及其应用,分子生物学与临床,中 山 大 学 主讲：杨 中 汉 （）,目 录,PCR的概念 PCR技术的创建 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的类型和应用,多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction),Polymerase: DNA聚合酶,基因组DNA,引物,DNA聚合酶,DNA片段体外扩增,PCR技术的创建,Kary B. Mullis（穆利斯（美）,Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 19
2、88年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,Kary B. Mullis（1944）,http:/,三篇重要论文,The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction (Scientific American, 1990,262(4):56-61, 64-5 ) Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermost
3、able DNA Polymerase (Science,1988,239(4839):487-91 ) Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Reaction (Methods in Enzymology, 1987,155:335-50 ),生物样品,DNA片段,基因诊断,基因治疗,基因工程产品,法医学检测,人类学研究,PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要,基因组DNA,获取特定DNA片段,扩增特定DNA片段,限制性内切酶裂解,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,基因组DNA文库,
4、DNA文库,20kB fragments,插入噬菌体载体,细菌扩增,裂解变性,显影,从基因组文库中筛选目的基因,probe,放射性核素 标记,转印,DNA克隆,目的基因,载体,复制子,宿主细胞,扩增,扩增,提取DNA分子,DNA聚合酶,引物,引物,1977年,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,1983年,94变性,50-65退火,XX延伸,94,55,37,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入
5、了PCR技术,72,94,55,PCR循环,PCR技术的原理,1 PCR技术的基本原理,无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。,体内DNA的复制,复习,DNA的变性和复性,加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。 解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原
6、有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。,PCR扩增原理,引物,延伸,延伸,5,5,3,3,变性、退火,变性、退火,2 PCR技术的特点,1 ）高度的灵敏性,30轮循环,扩增量达230个拷贝（109拷贝）,PCR产物每轮循环增加一倍,2 ）特异性,引物,引物,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,引物设计： （1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构
7、。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。,3,5,3,5,限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记,3）操作简便易行,PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。 通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。,目的基因,载体,复制子,宿主细胞,扩增,扩增,提取DNA分子,4 ）用途广泛,生命学科 医学工程 遗传工程 疾病诊断 法医学 考
8、古学,PCR的反应体系和方法,PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温( 72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。,总体积 50-100 l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶,1 反应体系,PCR技术的
9、基本过程(1),模板DNA dNTP 引物 Buffer,预变性,模板DNA dNTP 引物 Buffer,TaqDNA聚合酶,94oC5,2 基本过程,PCR技术的基本过程(2),Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer,循环仪,94 55 72 ,Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer,72 57 min,循环2535次,PCR技术的基本过程(3),1）PCR反应成分,（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,3 PCR反应条件,
10、（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。,（5） Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；
11、 Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 94oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。,（3）延伸 70-75,一般为72 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加,经典循环参数（500bp以内）,94 30s 55 45s 72 1min,94 5min,30次,72 7min,42
12、 forever,1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究,PCR的类型,高浓度引物,低浓度引物,2)反向PCR (reverse PCR),是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。,已知序列
13、,未知序列,未知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,3）多重PCR（复合PCR）,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,1,2,3,4,1,2,3,4,DMD：人类肌营养不良基因,A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子819缺失,B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者,C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式,多重PCR检测DMD基因缺失,4）LP-PCR（Labelled primers),利用同位素、荧光素等对引物进行标记,用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分,病毒1
14、病毒2 病毒 3 病毒4,标记引物,观察,PCR产物,5）锚定PCR（anchored PCR, A-PCR）,PCR的局限：需了解靶基因片段两测的序列,对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？,（固定化PCR）,VH,CH1,CH1,CH2,CH2,CH3,CH3,VH,VL,VL,CL,CL,cDNA,末端核酸转移酶,3GGGG,5,CCCC 锚定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增,6）PCR固相分析法,检测探针信号,可用于基因芯片的制作,7）原位,原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个
