工业微生物基因育种

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1、第五章 工业微生物基因育种,王陶 2012年2月,目的与要求,了解和掌握基因工程育种的原理与方法； 了解基因工程的主要载体与基因定位诱变的原理与方法。,教学重点：质粒的特性与基因工程操作原理 教学难点：基因定位诱变的原理,教学内容,1、概述 基因工程在微生物育种中的地位和作用，原理 2、基因工程载体 几种常见的载体 3、基因工程所用的酶 限制性内切酶，核酸酶，连接酶，聚合酶等 4、基因工程的主要步骤 5、基因定位诱变,一、基因工程概述,多利和它的孩子,沃尔小组成功克隆两只恒河猴,吴明杰小组：5只克 隆猪,基因操作，是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上、于本世纪70年代诞生的一门崭新

2、的生物技术科学。它的创立和发展，直接依赖于基因工程或称分子生物学的进步，两者之间有着密不可分的联系。基因的研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础，基因工程的诞生是基因研究发展的必然结果；而基因工程技术的发展和应用，又深刻并有力地影响着基因的研究，使我们对基因的研究提到了空前的高度。因此，对基因研究发展的过程，以及基因的现代概念进行一下回顾是十分必要的。,基因工程与基因,基 因（gene） 一段可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。,A brief history of genetics.,1866年，孟德尔（G.J.Mendel）提出了遗传因子（hereditary factor）的概

3、念。他将控制豌豆性状的遗传因素称之为遗传因子形成了基因的雏形。,豌豆杂交操作,孟德尔研究的七对性状,孟德尔分离律,孟德尔自由组合律,黄圆 绿圆 黄皱 绿皱,1909年，丹麦的遗传学家W. Johanssen根据希腊语“给予生命”之义，创造了“gene”一词。但它只是一个抽象的单位，并不代表物质实体。,同源染色体分别带着控制,同一性状的两个等位基因,显性等位基因 纯合子,隐性等位基因 纯合子,杂合子,1910年，美国遗传学家摩尔根 （T.H.M.organ）以果蝇为研究材料，发现了连锁交换定律并提出遗传粒子学说，第一次将代表某一特定性状的基因与某一特定的染色体联系起来，即基因位于染色体上。,野生

4、果蝇没有现成的成对性状 摩根在长期饲养中找到各个性状的突变株。,控制不同性状的等位基因,在2#染色体上的位置,触须 长/短,身体 灰/黑,眼睛 红/紫,翅 长/短,1944年，美国微生物学家O.T.Avery首次证实遗传物质的基础是DNA，基因位于DNA上。,The transforming principle is DNA.,DNA is the genetic material,35S 标记外壳蛋白质,感染后放射标记不进入大肠杆菌细胞,32P 标记 DNA ,感染后放射标记进入大肠杆菌细胞,1953年，J.Watson和F.Crike创立DNA双螺旋模型，证实基因是具有一定遗传效应的DNA

5、片段。,1955年，Benzer在T4噬菌体的顺反互补实验中，正式使用 “顺反子（cristron）”这个术语，并将顺反子与基因在意义上和功能上统一起来。 同时证实了基因不是最小单位。它仍然是可分的；并非所有的DNA序列都是基因，只有其中某一特定的核苷酸区段才是基因的编码区。,1960年，F.Jacob和J.Monmd提出了操纵元（操纵子）的概念，揭示了原核生物基因表达调控的重要规律。,基因的现代概念 移动基因（movable gene） 断裂基因（split gene） 假基因（pseudogene） 重复基因（repeated genes） 重叠基因（overlapping genes）

6、或嵌套基因（nested genes）,基因的特点 : 不同基因具有相同的物质基础 在原则上，所有生物的DNA都是可以重组互换的，因为地球上的一切生物，无论是高等还是低等，他们的基因都是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片断，而所有生物的DNA结构都是一样的。 有些病毒的基因定位在RNA上，但这些病毒RNA可以通过反转录产生CDNA，并不影响不同基因的重组互换。,基因是可以切割的 基因在染色体上的存在形式是直线排列。大多数基因彼此之间存在这间隔，少数基因是重叠排列的。,基因是可以转移的 生物体内有的基因是可以在染色体上移动的，甚至可以在不同的染色体上跳跃，插入到靶DNA分子中。基因在转移

7、的过程中就完成了基因间的重组。（转座子、反转座子）,多肽与基因之间存在对应关系 现在普遍认为，一种多肽就有一种相对应的基因。因此，基因的转移或重组可以根据其表达产物多肽的性质来检查。,多肽与基因之间存在对应关系 现在普遍认为，一种多肽就有一种相对应的基因。因此，基因的转移或重组可以根据其表达产物多肽的性质来检查。,基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代 经重组的基因一般来说是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物。,目前世界许多国家将生物技术，信息技术和新材料技术作为三大重中之重技术，而生物技术可以分为传统生物技术，工业生物发酵技术和现代生物技术。现在人们常说的生物技术实际上就是现代生物技术。

8、现代生物技术包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等五大工程技术。其中基因工程技术是现代生物技术的核心技术。,基因工程（genetic engineering） 也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。一般说来所谓的基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞中内，而能持续稳定的繁殖。,技术基础 20世纪60年代末70年代初，限制性内切酶和DNA连接酶等的发现，使DNA分子进行体外切割和连接成为可能。 70年代中期，DNA分子的核苷酸序列分析技术问世。 这两项技术，使DNA的结构分析问题得到了根本的解决

9、。 1972年首次构建了一个重组DNA分子，并提出了体外重组的DNA分子进入宿主细胞的过程，以及在其中进行复制和有效表达等问题。 在60年代还发展出了琼脂糖凝胶电泳和Southern转移杂交技术，这对于DNA片断的分离、检测十分有用，并很快被应用于基因操作实验。,基因工程研究的主要内容或步骤,从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段； 在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子； 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖； 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了

10、细胞重组DNA分子的受体细胞克隆； 从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用； 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。,基因工程流程示意图,基因工程的应用 基因工程技术已经在医学、工业、农业等各个领域得到了广泛的应用。,在医学上的应用 基因工程被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质肽类药物。,转基因动物和植物 转基因动物首先在小鼠获得成功。现在转基因动物技术已用于牛、羊，使得从 牛/羊 奶中可以生产蛋白质药物。称为“乳腺反应器”工程。 转基因植物亦已在大田中广为播,工程菌在环境工程

11、中应用 美国 GE 公司构造成功具有巨大烃类分解能力的工程菌，并获专利，用于清除石油污染。,喷洒工程菌清除石油污染,二、基因工程在微生物育种中的应用,1,提高代谢产物产量:例如所有的氨基酸合成酶基因都可以在不同系统中克隆与表达.其中苏氨酸,色氨酸,脯氨酸和组氨酸等工程菌已达到工业化生产水平.苏氨酸工程菌在前苏联和日本都已用于工业生产,苏氨酸产量可达60g/L以上,我国苏氨酸产量可达20g/L .,2,生产新的抗菌素 天蓝链霉菌合成蓝色的多酮肽抗菌素-放线紫红素,麦迪霉素产生菌合成褐色的麦迪霉素.经过两级克隆,麦迪霉素产生菌产生一种新的紫色化合物,是麦迪霉素与放线紫红素的杂种化合物,为一种新的抗

12、菌素,命名为MederhodinA.,3,改良工业酶生产菌株:蛋白酶,木糖异构酶,纤维素酶,葡萄糖淀粉酶以及凝乳酶等均进行了研究.研究较多的是-淀粉酶和青霉素酰化酶. 1981年起,在枯草杆菌或大肠杆菌中克隆和表达了来自枯草杆菌,淀粉液化芽孢杆菌,凝结芽孢杆菌,嗜热脂肪芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等菌种的-淀粉酶基因,比野生株最高的可达30倍.目前美国已用基因工程菌生产. 德国首先克隆大肠杆菌青霉素G酰化酶基因.我国青霉素G酰化酶的产量可达3000单位/L以上.,三、基因工程原理和步骤,一),目的基因的取得: 选择适宜的给体细胞,从中采集分离有生产意义的目的基因; 通过反转录酶的作用由mRNA合成c

13、DNA(互补DNA); 用化学方法合成特定功能的基因.,二),选择载体: 原核受体细胞的载体,主要是细菌质粒(松弛型)和噬菌体.动物细胞,主要是SV40病毒.植物细胞主要是TI质粒,三),目的基因与载体DNA的体外重组:采用限制性内切酶处理目的基因与载体DNA,获得互补粘性末端或人工合成粘性末端.把两者放在较低的温度(56)下混合“退火“.由于每一种限制性内切酶所切断的双链DNA片段和粘性未端有相同的核苷酸组分,所以当两者相混时,凡粘性末端上碱基互补的片段,就会因氢键的作用而彼此吸引,重新形成双链,这时,在外加连接酶的作用下,供体的DNA片段与质粒DNA片段的裂口处被“缝合“,形成一个完整的有

14、复制能力的环状重组体嵌合体.,四),重组载体引入受体细胞: 微生物,动物或植物细胞.使用最广泛的是E.coli.其次为枯草杆菌和酿酒酵母. 以重组质粒作载体,用转化方法; 以病毒DNA作重组载体,用感染方法. 理想情况,重组载体进入受体细胞,通过自主复制而大量扩增,使受体细胞表达出供体基因所提供的部分遗传性状,受体细胞就成为工程菌.,四、基因工程载体,载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的片段连接在它的上面，而进行复制，作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：,1、分子较小，可携带比较大的片段。 2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效

15、的复制。 3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。 4、有适合的标记，易于选择。 5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。 6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。,载体,功能 克隆载体（cloning vector） : 克隆一个基因或DNA片断 表达载体（expression vector）: 用于一个基因的蛋白表达 整合载体: 把一个基因插入到染色体组中,载 体,来源： 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 真

16、核细胞克隆载体,载体的种类和特征, 质粒（plasmid）载体 质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约106108D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。 作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。,质粒（plasmid） 是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA 分子。大小约为 数千碱基对。常 有1 3个抗药 性基因，以利于 筛选。,质粒载体,克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。 基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。,一、质粒的生物学特性： 1、质粒DNA的构型： SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（ocDNA） L 型 线性DNA（cDNA） 2、不同质粒的分子量大小差异相当显著： 106108D 3、作为载体的质粒都含有三种共同