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1、肠杆菌科及检验一、概述和通性肠杆菌科（enterobacteriaceae）是由多个菌属组成，其生物学性状相似，均为革兰阴性杆菌。这些细菌常寄居在人和动物的消化道并随粪便等排泄物排出体外，广泛分布于水和土壤中。大多数肠道杆菌属于正常菌群。当机体免疫力降低或侵入肠道外组织时成为条件致病菌而引起疾病。其中包括常引起腹泻和肠道感染的细菌（埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、耶尔森菌属）和常导致院内感染的细菌（枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、多源菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、普罗威登菌属和摩根菌属），以及一些在一定条件下偶可引起临床感染的细菌。（一）分类肠杆菌科细菌的种类繁多。主要根据细菌的形态、生化反应
2、、抗原性质以及核酸相关性进行分类。根据伯杰系统细菌学手册（1984年）将肠杆菌科的细菌分为20个属即埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属、哈夫尼亚菌属、爱德华菌属、普罗威登斯菌属、变形杆菌属、摩根菌属、耶尔森菌属等。（二）生物学特性1.形态与染色 肠杆菌科的细菌均为革兰阴性杆菌，其菌体大小为（1.06.0）m（0.31.0）m。多数有周鞭毛，能运动，少数菌属如志贺菌属和克雷伯菌属无鞭毛，无运动能力。均不形成芽胞，少数菌属细菌可形成荚膜。2.培养和生化反应 需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在普通琼脂培养基和麦康凯培养基上均能生长并形成中等大小的菌落，表面光滑，
3、液体培养基中呈混浊生长。发酵葡萄糖产酸、产气，触酶试验阳性，除少数菌外，氧化酶阴性。硝酸盐还原为亚硝酸盐，但欧文菌属和耶尔森菌属的某些菌株例外。3.抗原构造 肠杆菌科细菌的抗原构造复杂。包括菌体（O）抗原，鞭毛（H）抗原和表面抗原（如Vi抗原、K抗原）3种。0抗原和H抗原是肠杆菌科血清学分群和分型的依据。表面抗原为包绕在0抗原外的不耐热的多糖抗原，可阻断0抗原与相应抗体之间的反应，加热处理能破坏其阻断作用。4.变异 包括菌落SR变异和鞭毛H0变异。肠道杆菌易出现变异菌株，表现为耐药性或生化反应性质的改变。肠道杆菌易变异在细菌学诊断，治疗方面具有重要意义。5.抵抗力 不强。加热60，30分钟即被
4、杀死。不耐干燥，对一般化学消毒剂敏感。对低温有耐受力，能耐胆盐。6.肠杆菌科的初步分类 可根据苯丙氨酸脱氨酶试验和葡萄糖酸盐试验（也可用V-P试验）将肠肝菌科初步分为三大类。见下表。如表：肠杆菌的初步分类菌属名苯丙氨酸葡萄糖盐酸变形杆菌属普罗维登斯均属 - 摩根菌属 -克雷伯菌属- 肠杆菌属-* 沙雷菌属- 哈夫尼亚菌属- 埃希菌属- -志贺菌属 - -沙门菌属- -枸橼酸杆菌属- -爱德华菌属- -耶尔森菌属- -*有例外（三）致病性 肠杆菌科细菌种类多，可引起多种疾病：1.伤寒和副伤寒 由伤寒沙门菌和副伤寒沙门菌引起。2.食物中毒 由部分沙门菌（如丙型副伤寒沙门菌，鼠伤寒沙门菌）或变形杆菌
5、引起。3.细菌性痢疾 由志贺菌引起。4.其他感染 由大肠埃希菌、变形杆菌及克雷伯菌等条件致病菌可引起泌尿生殖道、伤口等部位的感染。（四）微生物检验1.分离培养将粪便或肛拭标本立即接种在肠道菌选择培养基上或先增菌后再分离；血、尿或脓汁等其他标本原则上不使用选择培养基。分离纯菌后，根据菌落特点，结合革兰染色及氧化酶反应结果作进一步鉴定。2.鉴定（1）初步鉴定：原则是：确定肠杆菌科的细菌，应采用葡萄糖氧化-发酵试验及氧化酶试验与弧菌科和非发酵菌加以鉴别；肠杆菌科细菌的分群，多采用苯丙氨酸脱氨酶和葡萄糖酸盐试验，将肠杆菌科的细菌分为苯丙氨酸脱氨酶阳性、葡萄糖酸盐利用试验阳性和两者均为阴性反应三个类群；
6、选择生化反应进行属种鉴别。有很多临床实验室习惯将选择培养基或鉴别培养基上的可疑菌落分别接种于克氏双糖铁琼脂（KIA）和尿素-靛基质-动力（MIU）复合培养基管中，并根据其六项反应结果，将细菌初步定属。（2）最后鉴定：肠杆菌科各属细菌的最后鉴定是根据生化反应的结果定属、种，或再用诊断血清做凝集反应才能作出最后判断。二、埃希菌属埃希菌属包括5个种，即大肠埃希菌、蟑螂埃希菌、弗格森埃希菌、赫尔曼埃希菌和伤口埃希菌。临床最常见的是大肠埃希菌。大肠埃希菌俗称大肠杆菌，是人类和动物肠道正常菌群。（一）生物学特性（性状）1.形态与染色 为革兰阴性短杆菌，（1.03.0）m （0.40.7）m。多数有周鞭毛，
7、能运动，有菌毛、荚膜或微荚膜。2.培养特性营养要求不高，在普通营养肉汤中呈浑浊生长。普通营养琼脂上，呈圆形，凸起，边缘整齐，灰白色的光滑型菌落，直径23mm。血琼脂平板上，少数菌株产生溶血环。在伊红亚甲蓝琼脂上，由于发酵乳糖，菌落呈蓝紫色并有金属光泽。麦康凯和SS琼脂中的胆盐对其有抑制作用，耐受菌株能生长并形成粉红色菌落。本菌为兼性厌氧菌。3.生化反应 发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇产酸产气，分解蔗糖因菌株而异，尿素酶试验阴性，吲哚、甲基红、V-P、枸橼酸盐试验（IMViC试验）为 ，有些菌株如碱性异型菌群，微产碱，不产气，无动力，易与志贺菌混淆。克氏双糖铁琼脂（KIA）上斜面和底层均产酸产
8、气，H2S阴性，动力、吲哚、尿素（MIU）培养基的生化反应为 。4.抗原结构 大肠埃希菌的抗原由菌体抗原（O）、表面抗原（K）和鞭毛抗原（H）三种构成。现已知有171种O抗原，100种K抗原和56种H抗原。一个菌株的抗原类型由特殊的0、K和H抗原的代码表示，其血清型别的方式是按0:K:H排列，例如O111:K58（B4）:H2。（二）致病性主要是侵袭力、内毒素、肠毒素等致病因素引起各种炎症（如胆囊炎、泌尿系感染、肺炎、新生儿脑膜炎、伤口感染、菌血症及腹泻等）。内毒素还可引起发热、休克、DIC等。1.肠道外感染 以泌尿系统感染常见，高位严重尿道感染与特殊血清型大肠埃希菌有关。还有菌血症，胆囊炎，
9、腹腔脓肿。2.肠道感染 引起肠道感染的大肠埃希菌有下列五个病原群。（1）肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）：引起霍乱样肠毒素腹泻（水泻）。（2）肠致病性大肠埃希菌（EPEC）：主要引起婴儿腹泻。（3）肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）：可侵入结肠黏膜上皮，引起痢疾样腹泻（黏液脓血便）。（4）肠出血性大肠埃希菌（EHEC）：又称产志贺样毒素（VT）大肠埃希氏菌（SLTEC或UTEC），其中O157:H7可引起出血性大肠炎和溶血性尿毒综合征（HUS）。临床特征为严重的腹痛、痉挛，反复出血性腹泻，伴发热、呕吐等。严重者可发展为急性肾衰竭。（5）肠黏附性大肠埃希菌（EAggEC）：也是新近报道的一种能引起腹泻
10、的大肠埃希菌。3.CDC将大肠埃希氏菌O157:H7列为常规检测项目 EHEC的血清型50种，最具代表性的是O157:H7。在北美许多地区，O157:H7占肠道分离病原菌的第二或第三位，是从血便中分离到的最常见的病原菌，分离率占血便的40%，6、7、8三个月O157:H7感染的发生率最高。且0157是4岁以下儿童急性肾衰的主要病原菌，所以CDC提出应将大肠埃希氏菌0157:H7列为常规检测项目。（三）微生物检验1.标本采集 肠道感染可采集粪便；肠道外感染可根据临床感染情况采集中段尿液、血液、脓汁、胆汁、脑脊液、痰、分泌液等。2.检验方法及鉴定（1）涂片与镜检：脓汁及增菌培养物发现单一革兰阴性杆
11、菌，可初步报告染色、形态、性状供临床用药参考。（2）分离培养：粪便标本可用弱选择鉴别培养基进行分离，脓汁等可用血平板分离，取可疑菌落进行形态观察及生化反应。（3）鉴定1）初步鉴定：根据菌落特征，涂片染色的菌形及染色反应，取纯培养物作生化反应。2）最后鉴定：一般常规检验做到初步鉴定即可，必要时可作系列生化反应最后鉴定。其中主要的鉴定试验为：氧化酶阴性、发酵葡萄糖产酸产气或只产酸、发酵乳糖产酸产气或迟缓发酵产酸、不发酵肌醇、IMViC反应为（占94.6%）、脲酶阴性、H2S阴性、苯丙氨酸脱氨酶阴性、硝酸盐还原阳性、动力多数阳性。3）某些大肠埃希菌，尤其是无动力的不发酵乳糖株，应与志贺菌相鉴别，两者
12、的主要鉴别试验可用醋酸钠和葡萄糖铵利用试验及粘质酸盐产酸三种试验。大肠埃希菌均为阳性，而志贺菌均为阴性。肠道外感染，经涂片染色，分离培养后，生化鉴定到种；由于大肠埃希菌是超广谱-内酰胺酶（ESBLs）的主要产酶株，该酶由质粒介导。应对ESBLs产酶株进行确认，根据药敏试验结果选用的有活性的抗生素进行治疗。对ESBLs产酶株所致感染需要采用碳青酶烯类-内酰胺类抗生素酶抑制剂或头霉菌素类进行治疗。肠道内感染还需做血清分型、毒素测定或毒力试验。食物、饮料、水等卫生细菌学检查，主要进行大肠菌群指数检测。4）血清学鉴定EPEC的血清学鉴定。EIEC的血清学鉴定。ETEC毒素的检测：采用改良Elek法测定
13、LT并采用乳鼠胃内灌注法检测ST。EHEC的血清学鉴定。EAEC的鉴定：检测细菌对HEP-2细胞或Hela细胞的黏附性。三、志贺菌属志贺菌属是人类细菌性痢疾最常见的病原菌，通称痢疾杆菌。根据生化反应与血清学试验该属细菌分为痢疾、福氏、鲍氏和宋内志贺菌四群，CDC分类系统（1989）将生化性状相近的A、B、C群归为一群，统称为A、B、C血清群，将鸟氨酸脱羧酶和-半乳糖苷酶均阳性的宋内志贺菌单列出来。我国以福氏和宋内志贺菌引起的菌痢最为常见。（一）生物学特性1.形态与染色 革兰阴性短小杆菌，（23）m（0.50.7）m，无荚膜，无芽胞，无鞭毛，有菌毛。2.培养特性 需氧或兼性厌氧，液体培养基中呈混
14、浊生长，在普通琼脂平板和SS培养基上形成中等大小、半透明的光滑型菌落，宋内志贺菌可形成扁平、粗糙的菌落。3.生化反应 志贺菌属的细菌分解葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖（宋内志贺菌可迟缓分解乳糖），吲哚试验阴性，H2S阴性，MR试验阳性，VP试验阴性，不产生赖氨酸脱羧酶，不能利用柠檬酸盐，氧化酶试验阴性，动力检验阴性。4.抗原结构 志贺菌属只有O抗原而无鞭毛抗原，个别菌型及新分离菌株有K抗原。O抗原分群特异性抗原和型特异性抗原两类。根据抗原构造可将志贺菌分为四个血清群，40余种血清型（包括亚型）。K抗原存在时能阻断O抗原与相应抗血清的凝集作用。加热100、60分钟可消除K抗原对O抗原的阻断作用，在
15、一定条件下可产生S-R变异及耐药性变异。（二）所致疾病1.急性菌痢。2.中毒性菌痢。3.慢性菌痢。（三）微生物检验1.标本采集 尽可能在发病早期及治疗前采集新鲜粪便，选择脓血便或黏液便，必要时可用肛拭子采集。2.检验方法及鉴定（1）分离培养：取粪便（黏液或脓血部分）或肛拭标本进行分离培养。一般同时接种强弱选择性不同的两个平板。强选择鉴别培养基可用沙门、志贺菌选择培养基（SS）；弱选择培养基可用麦康凯或中国蓝培养基。培养1824h后选取可疑菌落进行下列鉴定。（2）鉴定1）初步鉴定：挑选可疑菌落34个先用志贺菌属多价诊断血清作试探性玻片凝集试验。将试探性凝集试验阳性的菌落至少接种23支KIA和MIU，经35培养1824h，凡符合KIA：KA、产气一
