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1、糖生物学,第十章 糖基化工程,糖基化工程,糖基化工程的含义和意义 影响糖基化的因素 糖基化工程的手段 糖基化的监测 常用表达体系的糖基化特点 糖基化工程技术及其应用,Protein Market (2000),EPO2005年销售额超过百亿美元,Biogenerics: expiry date of patent and market,贫血,贫血是指循环中红细胞的数量和血红蛋白浓度低于正常值，不足以维持血液组织正常氧和作用的代偿机制病症。最常见的是缺铁性贫血、再生障碍性贫血、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血等。 治疗 (Pre-1989): 红细胞疗法（输血，连同维生素和矿物质）。 问题: 对某些贫
2、血不太有效。,Erythropoietin，EPO,美国Amgens 于1989年开发了Epogen（recombinant human erythropoietin，rhEPO） 促红细胞生成素 (erythropoietin, EPO) 水平在经历了化学疗法的癌症患者体内很低（尤其是肾衰竭者）。EPO可以刺激红细胞的生成， 并具有神经保护剂功能。 适应症: 红细胞生成不足引起的贫血 (来自肿瘤化疗、AIDS、慢性肾衰竭等),Erythropoietin Drug development,First cloned and expressed in bacteria: E. coli Bact
3、erial EPO is fully active: binds to tightly to the EPO receptor stimulates erythroid development has different binding kinetics than native hEPO while bacterial rhEPO is 500-fold less effective in vivo,N-linked glycans on EPO,High mannose N-glycans Complex N-glycans no sialic acid 3-4 sialic acid te
4、rmini no negative charges 3-4 negative charges,Sialic acid modication varies from 0-4 residues per N-glycan,3条N-糖链均为复杂型,have different numbers of glycosylation and sialation sites (%),Different Biotech Formulation,Some hrEPOs with varying sites of glycosylation (a post-translation modification of pr
5、otein) outlast others.,Amgens Biotech Business,Amgen的两大拳头产品： erythropoietin Epogen (epoetin alpha) colony stimulating factor Neupogen (filgrastim). 继Epogen后开发的新一代EPO产品仍是市场领军者： Aranesp (darbepoetin alpha) ：增加了两个Asn，使每分子EPO的唾液酸基团数量增加到22个。 Neulasta (pegfilgrastim)：对Neupogen进行PEG化修饰,PharmaFocus 2003,重组表
6、达的药用糖蛋白,世界生物医药市场主要品种大多为糖蛋白：rhEPO、GM-CSF、tPA等。全球产值约数百亿美元。 糖蛋白中的糖链对于药物在体内的稳定性、活性、靶向性及药代动力学有显著的影响，因此在开发这类药物时控制其糖基化具有较大的重要性。大多数情况下，对产品的糖基化必须予以优化和质量控制。,唾液酸化程度对EPO活性的影响,天然的和重组的EPO含有三条唾液酸化的复杂型N-糖链。 唾液酸化程度对EPO的体内半衰期有很大影响。 培养基pH、前体或营养成分的可利用性、不同细胞因子和激素的存在、细胞株中糖基转移酶和糖苷酶活性的强弱等因素均能影响培养细胞产物糖基化程度、分支程度、唾液酸化程度、硫酸化程度
7、等。,酶替代疗法中溶酶体酶的靶向,溶酶体贮积性疾病 Gauchers disease（葡萄糖脑苷脂酶缺陷）的酶替代疗法需要通过细胞表面的Man受体靶向到巨噬细胞的溶酶体。 可由哺乳动物生成的含有N-聚糖的酶经糖苷酶（唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶等）降解产生。 也可由杆状病毒-昆虫细胞表达系统加工生产。,糖基化工程的目的,控制蛋白质上的寡糖链加工，使其 增加合成及分泌的效率 增加溶解度 延长体内半衰期：如rhEPO的Sia基团 增强对抗蛋白酶的稳定性 增加生物活性 降低抗原性 靶向导入：如在酶替代疗法中溶酶体酶的靶向 有助于蛋白质的纯化等,影响糖基化的因素,多肽链自身结构 潜在糖基化位点的分布
8、和数目 蛋白质的空间结构 宿主系统糖基转移酶的表达 细胞培养的环境条件,糖基化工程的手段,体内控制 利用不同表达系统的糖基化差异 利用基因工程改变肽链上的糖基化位点 与GPI信号肽融合表达 重组表达糖基转移酶和糖苷酶等 体外修饰 利用天然的和合成的糖基化抑制剂 利用糖苷酶切除不需要的糖基 体外合成糖链 精确控制培养条件,常用表达系统的糖基化差异（一）,原核表达体系： 对重组蛋白不能糖基化 真核表达体系： 酵母： 酿酒酵母：过度甘露糖基化。需进行改造。 甲醇营养型酵母：Pichia pastoris; Hansenula polymorph：与哺乳动物接近 丝状真菌：表达异源蛋白比较困难,酵母表
9、达产物的糖型,常用表达系统的糖基化差异（二）,昆虫细胞/杆状病毒： 应用广泛的真核表达体系。但其生产的重组糖蛋白一般仅具有高甘露糖或寡甘露糖型糖链，难以生成复杂型糖链成为该系统的缺陷之一。 转基因植物：表达哺乳动物糖蛋白具有较高免疫原性 哺乳动物细胞： 广泛应用的CHO细胞株。 具有多种糖基化突变株。 转基因动物： 器官专一性。 需与乳汁中的其他寡糖分离。,植物糖蛋白中复杂型N-聚糖结构,结构的不同导致植物N-糖链具有高免疫原性 核心1,3Fuc（哺乳动物中主要为1,6Fuc） 1,2Xyl 能否合成Sia末端尚不清楚 植物的糖基化工程改造 缺失GlcNAcT-1基因 敲除某些糖基转移酶 使重
10、组蛋白C端带有内质网滞留信号H/KDEL,重组rhEPO的糖基化,糖基化位点 糖链结构和功能 表达体系对糖基化的影响 培养条件对糖基化的影响 糖基化的检测与质量控制,rhEPO糖基化程度的检测,SDS-PAGE（表观分子量） 等电聚焦电泳 高效液相色谱（HPLC） 核磁共振（1HNMR） 质谱（MS） 凝集素法（Lectin-binding assays for the isoforms of human erythropoietin: comparison of urinary and four recombinant erythropoietins. Journal of Endocrin
11、ology, Vol 150, Issue 3, 401-412） ： 鸡冠刺桐凝集素(Erythrina cristagalli agglutinin，ECA);与无唾液酸末端的具有Gal beta1-4GlcNAc 外链的糖连结合 朝鲜槐白血球凝集素(Maackia amurensis leukoagglutinin，MAL)：NeuAc alpha 2-3Gal beta 1-4GlcNAc,SDS-PAGE检测rhEPO的糖基化,BACK,思考,糖链在糖复合物中的功能 糖基化工程的技术和应用基因工程技术 糖基化的检测糖链分析方法 rhEPO综合应用实例,糖生物学,第十一章 糖生物学在医
12、药、工农业中的应用,糖生物学对医药领域的启示,医学 早期诊断：凝集素，糖芯片 药物设计 抗细胞粘附：精卵结合，炎症反应 抗感染 抗肿瘤转移 抗凝血 酶替代疗法治疗糖合成和代谢酶缺陷性疾病 酶抑制剂干扰有害糖代谢：糖尿病 提高靶向性 。 农药设计 杀真菌：干扰真菌细胞壁合成 杀虫：干扰昆虫体内特殊糖的代谢 激活植物自卫系统：寡糖素 重组蛋白类药物的糖基化工程 天然药物的糖基杂化、糖的酶法合成 。,糖生物学对医药领域的启示,寡糖类药物 分子和细胞识别抑制剂： 病原性微生物及毒素的抑制剂：分子小，可溶，可经呼吸道或肠道进入人体 抗炎症药物 精卵结合抑制剂 免疫增强剂：-葡聚糖 疫苗：细菌疫苗，肿瘤疫
13、苗 糖酶抑制剂：唾液酸酶抑制剂，阿卡波糖等 重组类糖蛋白药物 延长体内半衰期 提高药物的靶向性 治疗用蛋白聚糖：抗凝血、聚透明质酸等 器官移植急性排斥中的糖生物学 中草药活性成分,寡糖类抗感染药物,可口服或气管给药，不需注射 病原性微生物及毒素的抑制剂,寡糖类疫苗药物,细菌的糖疫苗：如Hib疫苗，使Hib感染发病率下降95%。 肿瘤的糖疫苗： 黑色素瘤、乳腺癌：GM2, GD2与蛋白载体缀合 乳腺癌：Sialyl 2-6GalNAc -（唾液酸Tn抗原） 对选凝素介导的白细胞穿行的抑制： SiaLex FucTVII酶抑制剂 抑制肿瘤转移：硫酸乙酰肝素抑制剂,拟糖类糖酶抑制剂药物,N-糖链加工
14、中的酶,寡糖类酶抑制剂作为药物,-葡萄糖苷酶抑制剂治疗糖尿病的原理,糖尿病药物中的糖基化抑制剂, -葡萄糖苷酶抑制剂研究现状 竞争性抑制剂：阿卡波糖、米格列醇等 非竞争性抑制剂（少）：染料木素等黄酮类物质 蛋白质非酶糖基化抑制剂研究现状 氨基胍、盐酸二甲双胍和苯乙双胍等肼类化合物 中药抑制剂：槲皮素和水飞蓟素等黄酮类物质,Acarbose,糖酶抑制剂作为抗虫农药,井冈霉亚基胺A,井冈霉素,井冈霉亚基胺昆虫海藻糖酶抑制剂,糖链合成抑制剂作为抗真菌农药,多氧霉素（Polyoxin）：几丁质合成酶的底物尿苷二磷酸乙酰氨基葡萄糖结构类似物,多氧霉素真菌几丁质合成酶抑制剂,农药寡糖,壳寡糖诱导植物产生几丁质酶，从而破坏病原真菌细胞壁结构 寡糖素诱导植物表达的防御素，提高抗病性,
