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1、Varioskan Flash仪器功能概述,Varioskan Flash,Varioskan 检测光路系统,Varioskan Flash 的光学部件结构,VF的光学结构由以下六个部件组成 激发光部件产生用于荧光和光密度检测的特定波长的光 测量部件产生高清晰的光束用于荧光和光密度检测，激发光参比检测器被整合入测量部件 发射部件对特定波长荧光和基于扫描模式的发光信号进行读数 光吸收测量模块检测穿过微孔的光密度信号 荧光底读模块引导来自光谱扫描模块的激发和发射光在底部检测微孔板荧光 灵敏的化学发光检测部件检测微孔板的光信号,激发光部件,光源 使用氙闪灯作为光源，氙闪灯提供光密度和荧光检测所需的宽
2、广的光谱范围，脉冲功率为100Hz,只在测量时才激活，短的光脉冲可以进行准确的时间分辨荧光检测。 一次检测根据检测质量和检测速度的要求可包括1-1000次闪烁脉冲。 衍射次序选择滤光片 （截止滤光片） 激发衍射次序滤光片实际就是Cut-off 滤光片，用于阻止不想要的单色器的谐波发射，正确的衍射次序滤光片是自动选择的。 单色器 单色器是基于衍射光栅，光栅的凹槽表面将不同颜色分散至不同的角度，通过光栅的转动来选择不同波长的光。 带宽选择 带宽是由单色器的狭缝宽度来设定的，二种带宽的选择（5nm和12nm)通过控制狭缝来产生。,干涉滤光片 interference film 利用干涉原理只使特定光
3、谱范围的光通过的光学薄膜。通常由多层薄膜构成。 干涉滤光片种类繁多，用途不一，常见干涉滤光片分截止滤光片和带通滤光片两类 截止滤光片能把光谱范围分成两个区，一个区中的光不能通过(截止区)，而另一区中的光能充分通过（通带区）。典型的截止滤光片有低通滤光片（只允许长波光通过）和高通滤光片（只允许短波光通过）它们均为多层介质膜，具有由高折射率层和低折射率层交替构成的周期性结构 带通滤光片只允许较窄波长范围的光通过，常见的是法布里-珀罗型滤光片，具体结构为：玻璃衬底上涂一层半透明金属层，接着涂一层氟化镁隔层，再涂一层半透明金属层，两金属层构成了法布里-珀罗标准具的两块平行板。当两极的间隔与波长同数量级
4、时，透射光中不同波长的干涉高峰分得很开，利用别的吸收型滤光片可把不允许透过的光滤掉，从而得到窄通带的带通滤光片，其通频带宽度远比普通吸收型滤光片要窄。另外还有全电介质的法布里-珀罗型滤光片 根据需要，带通滤光片的通频带可从红外到紫外。在可见光区，彩色电视摄像机中可利用这种滤光片把像分离成不同颜色；在红外区，常用于二氧化碳激光器、导弹制导系统及卫星传感器等,测量部件,测量光学部件是前表面的光镜系统，用于产生不受波长约束的，非常鲜明光束，在测量位F进行荧光和光密度检测。同时此测量部件收集进入发射读数通道的发射光。 在测量光束进入微孔前，先由参比传感器测一下光束密度，参比传感器的数据用于校准结果，以
5、补偿光源长时间闪烁和短时闪烁强度的波动。,发射光读数模块,发射光单色器 通过二个顺序连接的衍射光栅单色器获得高纯度的光线，带宽12nm。 发射衍射顺序滤光片 用于阻止不想要的单色器产生的谐波发射 发射光检测器 通过光电倍增管将发射光信号转化为电子信号，动力学范围自动可调或根据测量条件手工调节。手工调节有4种选择：低、中低、中高、和高范围。 除荧光检测，此模块也可用于化学发光光谱扫描。,光密度检测模块,光密度测量是将激发光模块作为光度测量的光源。 光密度测量模块位于测量位F,荧光底读模块,此模块基于光纤将光由光谱扫描模块传输至底读模块。 此底读光学部件位于测量位L。,化学发光检测模块,此模块是选
6、项，位于仪器前部，自动进样器之间。连接至测量位L 交叉干扰防护罩可阻止邻近孔的干扰，根据板的类型自动设定缝隙。有明确的缝隙选择可用于96、384和1536孔，大孔板还是使用96孔板的缝隙。,光吸收检测模式,光吸收检测模式原理,Varioskan Flash光吸收检测模式特点-光谱范围,光源：高能量氙灯 通过双单色光发生器（Double Monochromator）进行分光，最大程度消除光栅 分光过程中所产生的游离杂散光，确保所产生的光谱更纯 波长范围200 1000 nm ，波长连续可调，1nm递增量,光程校正技术-Pathlength correction,Path length,水平光路检
7、测（分光光度计检测方式） 使用比色皿 光程通常固定为1cm 光程与液体体积无关 OD 值只取决于液体浓度,A= c L,A = 吸光度值 = 消光系数 (摩尔吸光系数) C =浓度 L= 光程 (in cm),比尔定律,垂直光路检测（微孔板检测方式） 使用微孔板 光程与液体体积有关 OD值取决于液体体积和浓度,对于已知浓度的样品，其 c为常数（ k = c ）公式中k为Correction Factor 以水相溶液为例，水在970998nm处有吸收峰（975nm为特征峰）， A H2O = A975 A900，可确定1cm光程下纯H2O的A（以水为例，纯H2O的浓度为C=1000/18） 故可
8、根据水相溶液中水的A来确定溶液的高度，即样本实际光程L） 通过 L，将A校正为光程1cm条件下的A,A= c L,Pathlength correction光程校正技术原理,A= c L,A=A/L= c 1,Pathlength correction光程校正技术优越表现,1、将在微孔板上读出的OD值直接转换为1cm光 程下的OD值（分光光度值），无需通过标准品，在UV区可直接在微孔板上检测出核酸、蛋白的浓度，提高实验的平行性 2、将传统酶标仪(Microplate Reader)的检测精度提高到微孔板分光光度计(Microplate Spectraphotometer)的水平,光吸收模式技术
9、参数,荧光检测模式原理,Cuvette based and microplate fluorometer,Standard 90optics angles in a cuvette-based fluorometer,Typical Plate-Reading Fluorometer,Varioskan Flash荧光光路-四光栅,双激发光/双发射光（四光栅）设计方式： 激发光采用双单色器进行分光，发射光同样采用双单色器进行分光 该设计方式最大程度减少了游离杂散光的通过，产生最为纯的单色光，降低了杂散光干扰，避免了激发光反射光对发射光的干扰，大大提高了荧光实验的信噪比，,Ex,Ex,Em,Va
10、rioskan Flash荧光四光栅设计的优势,连续光谱荧光较滤光片荧光的优势,新的荧光染料，窄stokes Shift,1、适合于绝大多数荧光染料实验，无需更换滤光片 2、可进行荧光光谱扫描，优化实验条件，选择最佳 激发/发射波长，提高实验的灵敏度 3、可检测新型荧光染料（stokes shift较窄）和紫外 区荧光激发实验,连续光谱荧光较滤光片荧光的优势,半峰宽 (HBW) wavelength range of 50% fluorescence excitation or emission attainment of filter 通常荧光滤光片的带宽在25-55nm 之间 为避免HBW
11、的重合，滤光片式机器往往会选择并不位于最佳激发/发射位置的滤光片来提供波长，其结果造成荧光信号变弱，降低了检测灵敏度,同种荧光染料选择不同位置激发产生不同强度的发射光,Varioskan Flash荧光检测 -孔扫描，顶部、底部读数,Microwell scanning,Varioskan Flash! Absorbance Fluorescence Luminometry microwell scanning top and bottom reading,Varioskan Flash荧光光谱扫描 -荧光实验优化,定量实验需确定荧光染料最适激发/发射波长 对于已知荧光实验体系，通过光谱扫描可
12、优化实验条件： 许多荧光燃料对环境较敏感，如 buffer, pH 及温度的改变，因此需要优化实验条件，找出最佳波长 用于多标记及 FRET 实验 检测样品及试剂纯度 监测试剂或结合物的稳定性,Fig. 2 pH dependence of 4-MeU Emission spectra,Fig.1. pH dependence of 4-MeU Excitation spectra,Varioskan Flash荧光检测器 -光电倍增管（PMT）增益自动可调,AutoRange (自动调节) 最广的读数范围和最好的灵敏度 Manual range 比自动设范围读数更快: High range
13、用于高浓度样品 Low range范围较窄但灵敏度高 Medium range 灵敏度处于二者间，因此所测浓度亦介于二者间,荧光模式技术参数,时间分辨荧光模式,Varioskan-TRF检测原理,蛋白活性分析时间分辨荧光技术,免疫分析(TRF-ELISA),多标记荧光模式,荧光共振能量转移FRET检测,Distance (),Transfer efficiency (%),时间分辨能量转移实验: Perkin Elmer LANCE,根据能量转移从Eu标记的抗体 到受体SA-APC的原理 使得受体发荧光,Source: Perkin Elmer Corp. web site http:/,化学
14、发光模式,化学发光检测模式原理,发光信号很微弱，需仪器具有很高的检测灵敏度，amol水平； 荧光信号相对较强，一般检测器灵敏度在fmol水平,Luminesence: Chemi-luminescence Bio-luminescence,对于闪式反应类型（Flash type），仪器需配有自动加液装置 全程跟踪快速动力学反应过程，保证数据的完整性 有些实验需要先后加入两种液体，为保证无须中止测读即可进入下一反应，如dual-luciferase报告基因的实验。,化学发光反应类型-Glow&Flash type,Need Injector,single-and dual-luciferase
15、reporter genes（荧光素酶）,化学发光模式技术参数,Varioskan微孔板格式,光吸收模式下可读：6, 12, 24, 48, 96 & 384孔板 荧光模式下可读： 6, 12, 24, 48, 96 ，384 & 1536孔板；覆盖了从实验研发到高通量检测的各种应用 -根据通量要求，优化实验测定至不同板型高密度（孔数）板，提高了通量并减少了试剂用量，允许了更多的实验重复 -能直接测量细胞培养板，定区扫描功能可对每一孔进行多点测量，从而保证了整孔读数。这对基于细胞类实验尤为重要，因为细胞常常不均匀生长,Varioskan内置分液器,内置分液器，可分1 1000 l液量，递增量1
16、 l ， 优化动力学测量 分液体积: 1 1000 l，1 l 增量 适用板型: 6 384孔板 分液管嘴尺寸: D.tip 0.25 ( 0.25 mm) 可分 1 - 20 l D.tip 0.40 ( 0.40 mm) 可分 5 - 1000 1、分液和测量同步进行，使快速动力学反应在一开始即可被测量，如 酶动力学, Ca 2+ 通量 2、动力学测量的时间很容易被控制 ，可以使实验自动化，如 DNA 定量 (Hoechst dyes, PicoGreen) 3、方便处理有毒液体减少处理有毒液体的时间 4、结果可靠，无人为误差，可重复性高,分液速度可调，可优化实验结果!,Varioskan 分液器- Ca2+流实验,Varioskan 分液器优势,5-10% better,50% better,Varioskan温度控制装置,Upper
