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1、第九章 特 殊 染 色,一、特殊染色的概念及意义 特殊染色为常规染色（即苏木素、伊红）的必要补充，又称选择性染色，只有相对的特异性，如PAS阴性反应它有糖元。,意义： （1）特染能显示在常规染色切片中不明显的部分，如革兰氏染色、细菌染色。 （2）区别HE染色中不能鉴别的组织病变，如VG染色区别胶元纤维和平滑肌。 （3）显示某些常规染色中不能着色的物质，如网染才能显示网状纤维，常规HE染色是染不出来的。 因此，特殊染色也是制片染色中不可缺少的组成部分，它在病理诊断常着辅助作用，也为科研提供依据。,二、学习特染技术应掌握的重点 （注意事项） （1）染色方法的成败，应该在温度、浓度、时间和PH值等方
2、面找原因。 （2）注意特染的应用范围，如某种病变应用什么方法染色才能达到目的，一般先在HE切片所见的要求去选择适当的特染方法，一种或多种。,（3）必须掌握各种特殊染色的结果，避免导致错误的结论或严重的误诊，如在网染时把胶元纤维误以为网状纤维。 （4）尽量要阳性切片作对照，便于选择特染方法，并与HE切片作对照。 （5）特染的组织，在其固定、脱水根据要求选择。所用的器皿都必须化学清洗。,三、玻璃器皿的清洁 在病理实验室可用的玻璃器皿，都必须经过清洗干净才能使用，清洗的方法依玻璃器皿的新旧而不同。,1、新购玻璃器皿的处理 对于新购买的玻璃器皿应先用洗衣粉浸泡洗刷，自来水冲洗后再用12%盐酸水溶液浸泡
3、数小时后，用自来水冲洗干净，必要时可用少量蒸馏水洗2次,2、使用后玻璃器皿的处理 每次使用后的玻璃器皿都必须及时彻底清洗干净，以供下次实验之用，如轻视这一步骤，可用的玻璃器皿不够干净，则会影响染色效果，甚至导致染色失败，特别在酶组化和银离子反应操作过程中更有严格的要求，使用后的玻璃器皿在一般清洗后，还要求用硫酸清洗液浸泡。,硫酸清洗液配制 重铬酸钾 80g 自来水 1000ml 浓硫酸（工业用） 120m 新配制的清洁液为红褐色，反复使用一段时间后，慢慢变成绿色，说明清洁液已失败，不能继续使用应重新配制。,3、玻璃器皿的清洗方法 任何玻璃器皿都必须用自来水冲洗，然后把残余药液或染液洗去。 用毛
4、刷沾洗衣粉擦干净。 自来水冲洗，蒸馏水洗2次。 把晾干的器皿轻轻置入清洁液浸泡数日。 取出器皿，用自来水把器皿内外彻底冲洗干净，最后用蒸馏水洗2次。 把玻璃器皿倒置于有孔架上自然晾干或温箱中烤干，最后存放橱内备用。,常用的特染 第一节 结缔组织染色,一、胶元纤维染色（VG 染色） 胶元纤维的分部组成成分 胶原纤维是结缔组织中的三种纤维之一，分布最为广泛，含量最多。主要分布于真皮、腱、韧带、骨、透明软骨、动脉、肠壁 、子宫和基底膜等。胶原纤维具有韧性大，抗拉力强的特点。胶原纤维单位主要由纤维母细胞合成。,苦味酸酸性品红法 1 VG 染液试剂配制 1%酸性品红 10ml 苦味酸饱和液 90ml 此
5、液常分别配制临用时加以混合，不能久用。,【染色步骤】 （1）组织固定于10%早醛液中，常规脱水包埋 （2）组织切片脱腊至水。 （3）V-G染液2-5（酸性品红1：苦味酸饱和液9） （4）倾去染液，无水酒精急速脱水，用滤纸吸干 （5）二甲苯透明，中性树胶封片。,【结果】 胶元纤维呈红色，肌纤维、胞质及 红细胞黄色。, 胶元纤维染色应用 胶原纤维染色在病理诊断上主要用于鉴定梭形、纤维形细胞肿瘤的组织来源； 常常要在纤维、平滑肌和神经三者之中作出选择。 观察动脉硬化的心脏，在H切片中，心肌内散在的小疤痕灶和心肌均被染作红色，而作胶原纤维染色可将胶原组织和肌肉上明显地区分开来。 早期肝硬化用胶原纤维染
6、色，也可使小叶之间少量增生的胶原纤维突出地显示出来。,二、 网状纤维染色 网状纤维染色的形态特点和染色原理 网状纤维是网状结缔组织内的一种纤维。它由网状细胞产生，网状纤维细而有分支，穿行于细胞体和突之间，共同构成网状支架。这种纤维用HE染色一般不易辨认。若用银氨溶液浸染能使纤维变成黑色，故又称嗜银纤维。,（二）网状纤维染色的原理 网状纤维的染色方法很多，但是染色原理基本相同，有以下方面。 （1）氧化 使网状纤维具有选择性，不经氧化的切片，常用的氧化剂是高锰酸钾。 （2）漂白 一般采用2%草酸，漂白后无色,（3）媒染 多用2%硫酸铁氨（俗称铁明矾）。这些试剂可增加网状纤维对银氨液的选择性。 （4
7、）浸银 也称镀银，使银氨配位化合物与网状纤维结合，带正电荷的二氨合银Ag（NH3）+2被具有嗜银性物质的网状纤维吸附。 （5）还原 甲醛液是还原剂，能把与网状纤维结合的银氨配位化合物还原成棕黑色的金属银。,（三）网状纤维纤维染色应用 判定病变组织支架的破坏情况，组织、脏器网状支架的存在与塌陷、完整与破坏、网状纤维的分布及走行，有多少、粗细、疏密或有无断裂形态变化。, 用于显示和鉴别肿瘤的性质和来源 显示和区分癌与肉瘤 来源于上皮组织的恶性肿瘤（癌）仅癌巢周围有网状纤维包绕，巢内癌细胞之间则没有网状纤维分部。来源于间叶组织的恶性肿瘤（肉瘤），瘤细胞之间往往可见较多的网状纤存在。, 用于某些肿瘤的
8、诊断 根据染色所显示的网状纤维多少、分布及行走特点，可用于诊断下列肿瘤。,1）平滑肌肉 细胞之间见有大量平行分布的网状纤维。 2）纤维肉瘤 可见大量网状纤维存在，并且密集包绕细胞。 3）滑膜肉瘤 其梭形细胞也产生网状纤维，但不如纤维肉瘤多。, 用于观察和研究癌组织的发生、发展及其恶性程度 癌组织发生，发展过程以及癌组织生长速度，可通过网染进行观察和研究，如癌巢周围的网状纤维包囊完整，说明癌组织生长较慢，恶性程度低；再如子宫颈鳞状细胞癌巢周围网状纤维分解，说明癌组织正在扩散，其恶性程度较高。,(5) 用于显示和研究肝组织病变 用网状纤维的染色法，观察肝脏病变处的网状支架形态、分布特点及其破坏情况
9、，可以判定和研究其病变性质、程度及其发展与转规。,（四） 网状纤维染色的注意事项 （1）用新蒸馏水配制最好用双蒸水配制。 （2）所用玻璃器材及载玻片均要达到化学洁净程度. （3）对已配制好的硝酸银液和氨银溶液，要贮存冰箱中保存待用。,（4）在染色过程中，用染氨银染液或硝酸银液的前后应用蒸馏水洗浸。 （5）氯化金调色和硫代硫酸钠固定的时间不应太长，否则会引起网状纤维染色变淡。 （6）切片脱水后及时封片，不宜在空气中停留时间过长，以免产生色素颗粒。,【 氨银液的配制】 1.取10%硝酸银水溶液5ml于三角烧瓶内，一滴一滴地滴加氨水（氢氧化铵），并同时摇动容器 2.硝酸银遇到氨水立即产生沉淀，当其沉
10、淀物被溶解时（不能完全溶解也可） 3.再加入3%氢氧化钠水溶液5ml。溶液重新产生沉淀 4.此时再滴加氨水。至其沉淀被溶解后，（为避免氨水加入过量最好能有少许沉淀物为妥，以免脱片）最后加蒸馏水稀释至50ml。 5.滤过，贮存于棕色瓶中存放入冰箱备用。临用前取出恢复室温再用。,【染色步骤】 （1） 切片脱蜡至水洗。 （2） 0.25%高锰酸钾液氧化5。 （3） 自来水洗2次。 （4） 2.5%草酸液漂白1-2，水洗2。 （5） 2%硫酸铁铵媒染（铁明矾）10。 （6） 水洗，蒸馏水洗2次。 （7） 滴染氨银液1左右。,（8） 蒸馏水洗2次。 （9） 10%中性早醛还原3。 （10） 蒸馏水洗12
11、次。 （11） 0.2% 的氯化金调色5 水洗。 （12） 5%硫代硫酸钠固定5。 （13） 自来水冲洗，蒸馏水洗。 （14） 复染（对比染色）伊红、中性红、。 （15） 脱水、透明、封片。,【结果】 胶元纤维呈黄色，网状纤维成黑色。,【染色结果】 网状纤维染灰黑色，胶元纤维红色，基质 黄色。,三、弹力纤维染色法,弹力纤维较细，直径0.2-1微米，且坚固，弹性大，容易伸展，纤维分枝连接成网，HE染色与胶原纤维着色相似，若用弹力纤维染色法，则可分辨的很清楚。,Weigert氏弹力纤维染色法： 标本用Zenker氏液，酒精或10%甲醛固定均可。 石蜡或冰冻切片。 脱蜡至水。 水洗后，加入Weige
12、rt氏染色液2-6小时或更长的时间，一般依染色液的新旧而定 。,取出后，直接浸入1%盐酸酒精或酒精中进行分化。 如需复染细胞核，可染于明矾苏木素溶液中10分钟。 冲洗后，可再以V G氏染液作对比染色1-2分钟。 95%酒精分化、脱水、透明、封固。,试剂配制： 盐基性复红（碱性品红） 2g 间苯二酚（雷锁辛） 4g 蒸馏水 200ml 30%三氯化铁水溶液 25ml 95%酒精 200ml 浓盐酸 4ml,先将盐基性复红（碱性品红）溶于200ml的蒸馏水中， 加入4-5g间苯二酚，加温煮沸（不停搅拌）， 然后加入25ml的30%三氯化铁水溶液，继续搅拌煮沸2-5分钟，冷却后过滤倾去滤液，将滤纸及
13、沉淀物置于温箱中烘干。 而后将滤纸和干燥的沉淀物一并投入烧杯，加200ml 95%酒精，小心隔水加热，徐徐搅拌使沉淀溶解，然后弃去滤纸冷却后，补足因加热蒸发的酒精。 最后加入4ml的盐酸即可应用。（对苯二酚可代替间苯二酚）。,【注意事项】 Weigert氏弹力纤维染色的配制已有许多改变，盐基性复红（碱性品红）可由其它盐基性染料取代， 配制时如将结晶紫1克加盐基性复红1克，则弹力纤维染成兰绿色；全用甲紫或结晶紫，弹力纤维则呈暗绿色。,【染色结果】 弹力纤维蓝黑色，胶原纤维染成红色，肌纤维染成黄色。,小动脉光镜图 (弹性染色),Verhoeff氏弹力纤维染色法： 操作方法： 切片常规脱蜡。 Ver
14、hoeff染液15-60分钟。 以2%三氯化铁分化（镜下控制）。 水洗再以95%酒精洗去碘。 流水洗。 以HE或VG氏染液复染。 脱水、透明、封固。,【染色结果】 弹力纤维蓝黑色，其它组织视复染而定。 注意事项： 这种染色法染液配制简单，但对微细弹力纤维不如Weigert氏效果好。,试剂配制： 将1克苏木素加热溶于20ml的无水酒精， 冷却后，加1%三氯化铁水溶液8ml搅拌； 再加入 8ml的Lugoi碘液（碘1克，碘化钾2克，蒸馏水100ml）搅拌混合而成。 染液仅可存放2-3周。,应用：,1.显示皮肤组织中弹力纤维的变化 2.显示鉴别心血管疾病 3.显示呼吸系统和肾脏疾病时弹力纤维的变化
15、4.对弹力纤维瘤的诊断有决定作用,四、Masson三色染色法 Masson三色染色法是由Mallory氏苯胺蓝菊黄G发展改良而来，但对于固定液有一定的选择性，虽然任何固定液固定后的组织可进行染色，但最好是用Zenker氏固定液或Bouin氏固定液固定组织。福尔马林固定的标本切片在染色前以3%升汞作第二次固定一小时以上，则可增强着色效果。,操作方法： (1)切片常规脱蜡至水，蒸馏水洗； (2)Weigent氏苏木素液染核5分钟； (3)自来水洗； (4)1%盐酸分化 (5)自来水洗； (6)丽春红-酸性品红溶液染5-8分钟；,(7)1%醋酸水溶液洗； (8)1%磷钼酸分化（1-3分钟）直到各种成分被染清晰（胶原纤维呈淡红色，肌纤维、纤维素呈鲜红色） (9)2%亮绿液染2-5分钟（或用2%苯胺蓝水溶液替代） (10)水洗（快速） (11)常规脱水、透明、封片。,【染色结果】 胶原纤维绿色(亮绿)（或苯胺蓝,蓝色）肌肉、纤维素红色，红细胞橘黄色，核蓝黑色。,试剂配制： 1丽春红-品红溶液 丽春红 0.7g 酸性品红 0.30.5g 冰醋酸 1ml 蒸馏水 99ml 21%冰醋酸水溶液 冰醋酸
