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1、2019/2/27,1,第三章,农业基因工程,2019/2/27,2,第一节 基因工程的物质基础 第二节 基因工程操作程序 第三节 转基因植物与植物改良 第四节 转基因动物及应用,2019/2/27,3,第一节 基因工程的物质基础,一、基因工程的诞生 二、基因工程的含义 三、基因工程工具酶 四、基因工程载体,2019/2/27,4,一、基因工程的诞生,理论基础：三大发现 20C40S，基因载体是DNA 遗传物质基础问题； 20C50S，DNA双螺旋结构和半保留复制 基因的自我复制和传递问题； 20C50-60S，中心法则和操纵子学说 遗传信息的流向和表达问题。,2019/2/27,5,技术基础
2、：三大发明,工具酶 载体 反转录酶,2019/2/27,6,二、基因工程的含义,基因工程（gene engineering） 指将某种生物的基因经过体外修饰或直接导入另一种生物细胞或个体，从而改变生物的遗传性状或创造新的生物类型。 这种人为在遗传物质的分子水平上改造和设计生物的结构和功能的生物技术，就是所谓的基因工程，也称DNA重组技术。,2019/2/27,7,基因工程的优势,生物技术的核心技术 基因交换不受生物物种亲缘关系的限制。 生物基因可在人、动物、植物和微生物四大系统间进行交换，人类可以构思并创造出世界上前所未有的生物新类型。,2019/2/27,8,三、基因工程工具酶,基因工程操作
3、需要在分子水平上对DNA分子进行剪接、重组和转运，需要借助一些工具。 1、限制性内切酶 2、DNA连接酶 3、DNA聚合酶 4、反转录酶,2019/2/27,9,1、限制性内切酶,限制性内切酶就是一类能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的酶。 1970，Smith和Wilcox，Hind 1972，Boyer，EcoR 300种微生物500种限制性内切酶基因体外分析研究人工重组。,2019/2/27,10,2、DNA连接酶,作用：能把不同DNA片段结合到一起。 1967，首次发现，但活性不高 1970，Khorana，T4 DNA连接酶，高活性,2019/2/2
4、7,11,3、DNA聚合酶,DNA聚合酶能以单链DNA为模板合成互补的DNA链。 TaqDNA聚合酶：耐高温，70以上合成DNA。 这为体外人工大量复制目标DNA片段提供了极大的方便。,2019/2/27,12,4、反转录酶,反转录酶也是一种DNA聚合酶，但它不是以DNA为模板，而是以mRNA为模板进行DNA的合成。 由于这一过程正好与mRNA的转录过程相反，故而称为反转录酶。 反转录酶使得基因工程学家们能通过细胞质中的mRNA来认识和分离目标基因。 1970，Baltimore和Temin，各自发现。,2019/2/27,13,四、基因工程载体,载体：将外源DNA携带进入宿主细胞的运载工具。
5、 基因载体的实质：一类小型的DNA分子。 其作用：将目的基因转移到受体细胞，并使其在受体细胞中得到转录和表达。 1946，Lederberg，细菌F因子 1973，Cohen，首次将质粒作为基因载体。,2019/2/27,14,理想载体的特点,自我复制能力； 大小要适度，能从外部进入细胞； 稳定安全可靠，不易降解； 要有遗传标记和选择性的识别标记。,2019/2/27,15,载体的分类,（1）根据克隆外源DNA的方式： 插入型载体：指在载体的克隆位点上用限制性内切酶酶切后，将外源DNA插入，再用连接酶连接。绝大多数的载体都属于此类。 置换型载体：指载体的某一片段用限制性内切酶切除，代之以外源D
6、NA片段。噬菌体属于此类。 （2）根据载体的用途： 克隆载体：指克隆了外源DNA后，转入宿主细胞中进行增殖，使克隆的DNA片段在数量上大大扩增。 表达载体：将外源DNA在宿主细胞中表达产生蛋白质。,2019/2/27,16,常用基因载体,质粒 噬菌体 病毒 转座子 人工载体,2019/2/27,17,质粒,质粒是独立与染色体之外的能自主复制的双链环状DNA分子，也叫“核外遗传体或核外染色体”。 质粒所携带外源DNA片段比较小（10Kb）。 Ti质粒：高等植物基因工程常用。,2019/2/27,18,噬菌体,噬菌体所能负载的DNA片段较大。 噬菌体：双链线性DNA。 原核生物常用。,2019/2
7、/27,19,病毒,SV40（猿猴病毒），双链环状DNA 广泛应用： 微生物和哺乳动物体细胞基因工程。,2019/2/27,20,转座子,能在基因组中频繁转移，主要成分也都是不同的DNA。,2019/2/27,21,人工载体,YAC（酵母人工染色体） Yeast artificial chromosome BAC（细菌人工染色体） Bacterial artificial chromosome MAC（哺乳动物人工染色体） Mammalian artificial chromosome,2019/2/27,22,第二节 基因工程操作程序,一般包括5个步骤： 一、目的基因的获得； 二、目的基因与
8、基因载体的体外重组； 三、重组DNA分子的转化； 四、转化细胞的筛选； 五、目的基因表达的检测。,2019/2/27,23,基因转化操作过程,2019/2/27,24,一、目的基因的获得,目的基因：在基因工程操作中所需要的某些DNA分子的片段。 它含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。 目的基因获得方法： 人工合成法、 cDNA法、 PCR法、 基因文库筛选法等。,2019/2/27,25,1、人工合成法,核苷酸 酶 目的基因 注：该法合成目的基因较小。,2019/2/27,26,2、cDNA法,特定基因 分离 mRNA 反转录酶 G、C、T、A 单链cDNA 目的基因,2019/2/27,2
9、7,3、PCR法,前提：已知序列 方法：多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR） 程序：通过DNA模板高温变性、模板与引物的低温退火及引物的中温延伸3个阶段的多次循环，就可以扩增得到目的DNA序列。,2019/2/27,28,4、基因文库筛选法,基因文库就是保存某个物种完整基因组遗传信息的不同DNA片段的总称。 前提：核酸序列未知 程序：蛋白质纯化测定部分氨基酸的顺序合成DNA探针从基因文库中筛选目的基因。 原理：中心法则,2019/2/27,29,二、体外重组,载体+目的基因 重组DNA （基因工程最重要的环节） 1、选择适合的基因载体 2、载体酶切（限制
10、内切酶） 3、目的基因与载体DNA 连接（DNA连接酶） 4、重组DNA分子获得,2019/2/27,30,三、重组DNA分子的转化,将重组的DNA杂合分子，向选定的生物受体细胞（或叫宿主细胞、寄主细胞）中转移，让重组的DNA杂合子在受体细胞中自主复制、转录、翻译得以表达。 常用大肠杆菌作为宿主细胞。,2019/2/27,31,常用转化方法,（1）Ti质粒介导法 （2）电击法 （3）微注射法 （4）基因枪法,2019/2/27,32,（1）Ti质粒介导法,基因载体：农杆菌Ti质粒。 优点：转化再生率高 最常用的方法。,2019/2/27,33,（2）电击法,瞬间电脉冲刺激细胞膜小孔 重组DNA
11、分子进入细胞的通道。 电脉冲强度孔径大小和数量 DNA进入细胞的速度和难易。,2019/2/27,34,（3）微注射法,毛细管针显微操作注射外源基因细胞。 优点：准确性高 缺点：技术性高，处理效率低,2019/2/27,35,（4）基因枪法,特制“基因枪” 外源基因+金属微粒=“微型弹” 射入受体细胞。 优点：批量处理，效率高； 缺点：装置昂贵。,2019/2/27,36,提高转化率的方法,（1）多聚氨基酸法 （2）磷酸钙DNA共沉淀法 （3）脂质体法,2019/2/27,37,（1）多聚氨基酸法,多聚氨基酸 + 重组DNA分子 DNA多聚氨基酸复合分子 常用：多聚-L-鸟氨酸 多聚-L-赖氨
12、酸 该结构：保护外源基因免受核酸酶的降解。 刺激宿主细胞提高其摄入能力。,2019/2/27,38,（2）磷酸钙DNA共沉淀法,D重组NA分子 + 磷酸钙 磷酸钙-DNA复合体 （沉淀状） 作用：同上法。,2019/2/27,39,（3）脂质体法,重组DNA悬浮液 + 10%矿物油或橄榄油 剧烈振荡 包膜 脂质体（内裹DNA分子） 稳定性好，对核酸酶具有较好的抗性。,2019/2/27,40,四、转化细胞的筛选,转化处理受体细胞 培养基（抗菌素） 转化细胞（抗性基因） 未转化细胞 培养 重组DNA,2019/2/27,41,五、目的基因表达的检测,合成 外源基因 蛋白质 检测,2019/2/2
13、7,42,六、基因工程操作实例,抗除草剂和多价抗虫基因导入水稻光温敏核不育系的研究 1. Epsps基因为筛选标记的多价抗虫表达载体构建,2019/2/27,43,1.1 多基因表达载体构建的流程和图谱,2019/2/27,44,pC1300pCTSM1300pCT-pinII-1pCT-Bt-2pCTSKC3,2019/2/27,45,1.2 .载体构建的部分电泳鉴定图谱,图1-6 GNA基因的PCR鉴定 Lane1,2: pCTSKC3 （460bp） Lane3 : pKC-3 （460bp）,220bp,1.3 Kb,图1-7 TSP和aroAM12基因的PCR鉴定 Lane1: 15
14、kb DNA marker Lane2 , 3: TSP sequence (200bp) Lane4, 5: Epsps gene (1.3kb),图1-8 Bt 和 PinII 基因的PCR鉴定 Lane1: pCTSKC3 /Bt gene（300bp） Lane2 : pCTSKC3 / PinII gene （566bp） Lane3 : pKC-3 /PinII gene（566bp）,2019/2/27,46,2019/2/27,47,愈伤组织诱导生长过程图,接种7d的愈伤组织,刚接种的愈伤组织,2019/2/27,48,2.2 愈伤组织的转化基因枪法和农杆菌法,2.2.1 材料
15、 生长旺盛，结构致密，颜色淡黄的胚性愈伤组织 多基因表达载体pCTSKC3 ，pCAMBIA1300 农杆菌株EHA105 2.2.2 基因枪转化法 转化前，将愈伤组织按每皿25-30块，放置在平皿 中心 2.5cm范围内，然后置于高渗培养基上暗培养 4h。,2019/2/27,49,质粒DNA用量约 25ug/ 6枪，可裂膜的压力为 7.58MPa，靶材料至可裂膜距离为 6cm, 真空度0.08 Mpa，每皿材料 轰击2次 。 2.2.3 农杆菌转化法 质粒DNA转化农杆菌EHA105 。 菌液OD6000.6，稀释度为 2倍, 侵染时间为 30 Min, 共培养时间为3d。,2019/2/
16、27,50,2.3 结果与分析,原因,2019/2/27,51,2019/2/27,52,3.1 材料和方法,3.1.1 材料 转基因植株基因组DNA；负对照的基因组DNA； 正对照的基因组DNA。 3.1.2 方法 (1) PCR PCR反应条件：94 5 Min，94 45 s，59 1 Min，72 1.5 Min，30个循环后，72延伸10 Min。 (2) Southern blot 操作流程: 基因组DNA酶切 琼脂糖凝胶电泳 转膜 探针制备 杂交 洗膜 显影,2019/2/27,53,3.2.1 部分转基因植株的PCR 检测,M：100bp marker ; P：阳性对照（pCTSKC3）; CK：阴性对照；111：转基因植株,2. Bt基因PCR检测（ 30
