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1、基因工程技术 (Genetic engineering),2. 基因工程（genetic engineering）：在分子水平上用人工方法提取或制备DNA，在体外切割，与载体连接成重组体，然后采用一定方法把重组的DNA分子导入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要表达不同的蛋白产物或定向的创造生物的新性状，并使之稳定的遗传给子代。,一、基本概念,1. 基因（gene）：是生物体传递遗传信息和表达遗传信息的基本单位。目前认为它是合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部核苷酸序列。,分：目的基因的获取、载体的选择 切：限制性内切酶的应用 接：用连接酶将目的基因和载体连接重组体
2、 转：将重组体导入到受体细胞 筛：采用适当的方筛选出含有目的基因的阳性克隆 表：目的基因在受体细胞表达，获取表达产物,二、基因工程的基本程序： 分、切、接、转、筛、表,分,切,接,转,筛,表,三、基因工程实验特点及要求,1. 微量操作 2. 连续性操作 3. 低温操作 4. 防止污染（杂质污染、细菌污染） 5. 实验物品切忌乱扔乱丢 6. 认真写好实验纪录,第一次实验: 质粒DNA大量制备、浓度分析 第二次实验：DNA限制性内切酶消化、电泳、片段回收、重组连接 第三次实验：重组质粒的转化、 PCR 第四次实验：重组质粒的鉴定（质粒DNA小量快速制备）、杂交 第五次实验：显色、考试,实验一 质粒
3、DNA大量制备、浓度及纯度分析,目的：获得高浓度、高纯度的质粒DNA。为酶切和基因转染作准备。,质粒 （plasmid）：存在于细菌染色体外的环状双链DNA,能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。,载体的选择标准,能自主复制； 具有遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。,基本步骤：,细菌的生长和质粒的扩增: 将表达质粒DNA的活细菌进行大量培养。 细菌的采集和裂解,抽提质粒DNA：碱变性法提质粒 ； 质粒DNA的提纯:除蛋白质、RNA和与质粒DNA分
4、子量相近的断裂染色体DNA 。,碱变性抽提质粒DNA原理：,利用质粒DNA与染色体DNA分子大小不同，变性和复性的差异。 在pH=12.6的NaOH-SDS环境下，质粒DNA与染色体DNA的氢键均破坏，但是染色体DNA断裂成线状，而质粒DNA仍为闭环，且相互缠绕没有分开。当pH调整到7.0，质粒DNA复性存在溶液中，而染色体DNA不能复性与变性的蛋白质、SDS相互缠绕形成沉淀，经离心被分离。,质粒DNA的纯化：,蛋白质的清除：蛋白质的变性剂酚和氯仿. RNA的清除：RNA酶消化；LiCl沉淀;层析。 与质粒分子量相近的线状断裂的染色体DNA的清除：等体积1.6mol/L NaCl , 13%P
5、EG; CsCl梯度超速离心等。,CsCl密度梯度超速离心法：,CsCl是一种高分子量的重金属盐，在较长时间超速离心后，形成浓度梯度，当DNA的沉降速度与扩散速度达到平衡时，染色体DNA、质粒、RNA等各分离颗粒，在密度梯度中沉降或漂浮。他们在密度梯度中的位置分布不依据沉降速率、分子大小及离心时间，而是取决于密度。EB是一种丫啶类染料，可嵌入双链DNA的碱基之间，使DNA的解旋体积增大，浮力密度变小。EB与环状质粒DNA的结合量小于线状染色体DNA的结合量，故质粒DNA的浮力密度大与线状染色体DNA, 位于离心管的下层。RNA总是与Cs+结合，密度最大，超离时位于管底。,Sepharose 2
6、B柱层析法（琼脂糖凝胶柱）,利用分子筛效应，分子量大的分子不能进入凝胶颗粒网孔，顺着颗粒间隙先流出，分子量小的分子进入凝胶颗粒孔经内，流程长，后流出来。质粒DNA分子量大于RNA，故先洗脱下来。,LiCl沉淀法：Li+可与RNA结合，形成锂盐沉淀，而DNA不与锂结合，故经离心可将二者分离。注意在变性阶段，操作要温柔，不要使染色体DNA断裂。 聚乙二醇沉淀法：只沉淀环状DNA,操作步骤:,收集细菌,GET,悬浮,SDS-NaOH,pH=12.6,碱变性,KAc,pH=4.8,质粒DNA完全复性,染色体DNA不能复性,离心,上清: 质粒,小分子RNA, 少量蛋白质,沉淀: 染色体DNA, 大分子R
7、NA , SDS-蛋白质复合物,取上清, 加等体积异丙醇沉淀DNA(缩小体积),离心,沉淀溶于TE,等体积LiCl,沉淀RNA,离心,加等体积酚 氯仿异戊醇,去杂蛋白,离心,取上 层水相,酚氯仿异戊醇 重复一次,离心,取上层水相,2倍体积无水乙醇 0.1体积NaAc,沉淀DNA,离心,70%乙醇清洗沉淀,晾干,TE(50ul)溶解沉淀,取5ul电泳鉴定,取上清, 加等体积异丙醇沉淀DNA(缩小体积),离心,沉淀溶于500ul TE，RNA酶消化30min,DNA片段的琼脂糖凝胶电泳分离,原理 以琼脂糖为电泳支持物，DNA因分子大小、形状、构象不同，在相同的电泳条件下，因迁移率不同而被分离。DN
8、A可与荧光染料溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯照射下呈桔红色荧光条带。 DNA可与荧光染料Goldview结合，在紫外灯照射下呈绿色荧光条带。 。 琼脂糖凝胶电泳的优点：操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理；琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98-99），近似自由电泳，样品扩散较自由电泳小，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；凝胶透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用字外监测及定量测定；区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定，制成干膜可长期保存。,DNA的琼脂糖凝胶电泳影响因素：,1. 核酸分子大小：迁移率与分子量的对数成反比，但当20kb时，迁移率不在依赖于分子大小； 2. 核酸构
9、型:分子量相同的情况下，共价闭环DNA直线DNA开环环状DNA 3.与凝胶浓度关系:一定大小的DNA在不同凝胶浓度中迁移率不同； 4.其它影响因素：缓冲液的成分、离子强度及电压（5v/cm）等,DNA浓度及纯度分析: 紫外分光光度法,双链DNA: 1OD260nm= 50ug/ml 单链DNA或RNA: 1OD260nm= 40ug/ml 核苷酸: 1OD260nm= 20ug/ml,RNA:,OD260nm,OD280nm, 2.0,DNA:,OD260nm,OD280nm,= 1.7,2.0, 蛋白质污染,1.7, RNA污染,1.7, 蛋白质污染,结果分析：,线状DNA,超螺旋DNA,第
10、二次试验：构建重组DNA,载体的酶切消化 酶切产物琼脂糖凝胶电泳 DNA片段回收 目的基因、载体重组连接,一、质粒DNA的限制性内切酶消化酶解,原理 限制性内切酶（restriction enzyme）是细菌体内含有的一类能特异识别双链DNA分子的特定序列，并对其进行切割的核酸内切酶。共有三类，其中二类因其有固定的切割位点，只有酶限制性无修饰性，不需要ATP，实用性大，是基因工程常用工具酶之一。 作用： 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。 其识别序列特点及酶切产物：4-6bp，回文结构；粘性末端或平端,BamH,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,命名方
11、式（以Hind III为例）： 属： HHaemaphilus 种： ininfluenza 株： d株 编号： ,同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,+,Bam H,+,Bst,同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,限制性内切酶（）单位及实际用量： 在限定的温度和反应环境中，小时消化1ugDNA所需的酶量为一个酶单位。由于种种原因，一般使用3-5u/ugDNA，延长小时以上，是酶切反应更彻底。 RE
12、保存条件：50%甘油中，用时需稀释10倍以上才能解除抑制。,酶切系统组成及计算方法：根据DNA量计算酶的用量，再计算酶切系统总体积、缓冲液和水的用量。,质粒DNA 10ug(10ul) 1ug/ul 10buffer 1.5-2.5ul RE 30-50U(1.5-2.5ul) 20U/ul d3H2O 6ul 总体积 15-25ul 加样顺序：先加水，再加buffer和DNA，最后加酶,操作步骤：,质粒DNA 20ul ( 10ug ) 10buffer 3 ul Xbal 1.5 ul (30U) Hind III 1.5ul (30U) d3H2O 4ul 总体积 30ul 加样，短暂离
13、心，370C水浴消化。,三、DNA片段回收及纯化,DEAE纤维素膜的电泳回收方法：紧靠目的DNA片段前方切一裂隙，将一条DEAE纤维素膜插入裂隙中，继续电泳直至条带中所有的DNA均收集到膜上，然后从裂隙取出膜，用低离子强度的缓冲液洗掉污染物，最后在高离子强度的缓冲液中将DNA洗脱下来。此方法简单，可同时用于许多片段，且获得的DNA极纯，但仅适用于小片段DNA（15Kb的DNA片段和单链DNA不适合，因难以洗脱下来。,三、DNA片段回收及纯化,透析袋电洗脱法：将含有DNA片段的凝胶切下置于充满1xTAE的透析袋中，使凝胶块沉下，去掉大部分缓冲液，在凝胶上方夹紧透析袋，不留气泡，将透析袋浸泡在1x
14、TAE电泳槽中，电泳2-3小时，使DNA从凝胶中电洗脱下来。此法可以回收大小范围较宽的DNA，但很不方便。 从低溶点琼脂糖凝胶中回收DNA：琼脂糖的糖链上引入了羟乙基，在300C左右成胶，大约在650C熔化，在大多数双链DNA熔点温度以下。 采用挖槽法 酚冻法。,纯化：,1.DEAESephacel柱层析法：将带负电荷的DNA结合到一种阳离子基质上而将污染物洗脱下来，在提高缓冲液的离子强度将DNA 洗脱下来。 2.有机溶剂抽提法：用2-丁醇和酚氯仿抽提。,制胶 点样 电泳分离 回收片段 抽提沉淀DNA。,操作步骤:,结果分析：,分子量标准：噬菌体的DNA，全长49.01kb，经Hind消化产生
15、7条带，23.7kb, 9.46kb, 6.75kb, 4.26kb, 2.26kb, 1.98kb, 0.58kb 完全酶解的质粒有两条带及目的基因和载体，分别为1.1kb和5.4kb，应位于1.98 和0.58kb及4.26-6.75kb之间 溴酚蓝前的绿色带为RNA 若酶解未完全可能出现超螺旋、线性、开环三种构象。,marker,plasmid,RE digested,四、DNA片段的重组连接,原理 1. 在T4DNA连接酶的催化下，载体基因片段与目的基因片段的粘性末端共价结合,连接,环化成重组环状DNA分子。,2.连接方式：粘接、平接、尾接、人工接头器 3.影响重组连接因素:目的基因的浓度与载体的比例(3-5:1)；离子浓度；温度：14-160C。 4.DNA连接酶单位：用Weiss单位对酶进行标化：1个Weiss单位指在370C下20分钟内催化1nmol32Pi从焦磷酸根置换到,-32PiATP所需的酶量。,（三）外源基因与载体的连接,1. 粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶 15C,同一限制
