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1、第六章 荧光分光光度法,基本要求： 了解荧光光谱法的基本原理和应用特点。了解荧光分光光度计的组成以及特点。掌握荧光光谱法的定量分析方法。了解影响荧光强度的因素。,第一节 概论,回顾：,四大类,一、应用：,1.定量分析 能产生荧光 或能形成荧光配合物的物质。 2.简单定性 回答“是不是”。,二、特点：,灵敏度高，比吸收光谱法高10104倍。ppb 选择性比吸收光谱法好。,第二节 基本原理,一、分子荧光的产生 物质吸收光辐射 价电子从基态跃到激发态，然后再回到基态 释放能量以热能的形式。以光辐射的形式。以光辐射形式释放能量时，发射荧光。这种现象称为光致发光。,最常见的光致发光：荧光和磷光。 两者发
2、光机理不同，寿命不同。荧光寿命10-910-6秒，磷光寿命10-310秒。 荧光可由激发态的分子产生，也可由激发态的原子产生，本章介绍分子荧光。 由于荧光的产生由价电子引起，所以，荧光光谱属于电子光谱，其波长范围位于：紫外光区和可见光区。,二、激发光谱和发射光谱, 激发光谱 固定荧光波长，以激发光波长对荧光强度(F)所作的光谱曲线。, 发射光谱 固定激发光波长，以荧光波长对荧光强度F所作的光谱曲线。,三、分子荧光与分子结构的关系,分子要产生荧光，首先要能吸收紫外光或可见光。,能产生荧光的分子具有的结构特点：,【例】,芴具有刚性平面，产生的荧光比联二苯强。,四、荧光强度与浓度的关系,：量子效率，
3、发射光量子与吸收光量子之比。 I0：入射光强度 ：摩尔吸光系数 b： 光程 c：浓度,F=2.303I0bc,公式成立前提条件：bc=A0.05 即：当试样浓度较低时（c0.05/b），C与F方成线性。（如果浓度过高，分子碰撞机会增大，而产生无辐射去激活，造成线性偏离。）,第三节 荧光分光光度计,一、基本结构示意图,特点：1 光源方向与检测方向成直角； 2 二个单色器。,二、主要部件及功能,1光源 高压汞蒸气灯，氙灯。 能提供紫外光和可见光，光强度比紫外-可见光分光光度计光源大得多。 2激发光单色器 作用：提供单波长的激发光。 色散元件：棱镜或光栅。 出射狭缝宽度可调 。,3样品池 须用石英材
4、料制成。 4荧光单色器 将样品池中的散射光、反射光、杂质荧光等滤掉，只让荧光通过。 出射狭缝宽度可调。 5检测器 光电转换元件，测定荧光的强度。 检测方向与激发光方向垂直：在垂直方向上没有透过光的干扰。 由于荧光的强度较弱，一般以光电倍增管作检测器。,第四节 定量分析,一、定量方法 一般采用工作直线法。作CF直线。,配制一系列待测成分的标准溶液 C1 C2 C3 C4 C5 测出相应的荧光强度 F1 F2 F3 F4 F5 建立工作直线（ F C） 作图法 回归法 测量待测样品，得F样 从工作直线上找到待测成分的浓度C样 由回归方程计算出C样,二、影响荧光强度测定的因素,1激发光照射 有一些荧
5、光物质若受到强光照射，会发生分解而导致F。 所以，荧光分光光度计通常在激发光单色器后装配有光闸，在 测定时才打开光闸让激发光照射样品池。 2温度 温度，荧光效率下降，F。（因为，温度，增加分子间 碰撞机会而使能量消耗掉。）,4溶剂 有些溶剂会使荧光效率下降，也可能带来干扰荧光。,所以，有时需要pH缓冲液控制pH值在适当范围内。,3pH值 pH值能改变某些荧光物质的电子构型从而影响荧光强度。,灵敏度高。可高达ppb级（10-9），甚至ppt级（10-12）。 选择性好，与能产生荧光的物质少有关。,三、定量分析的特点及应用,思考题,一、概念 （荧光）激发光谱 （荧光）发射光谱,二、问答题 试述分子荧光产生的过程。 试述分子荧光强度与浓度的关系式，并说明公式成立的前提条件及原因。 分别说明荧光分光光度计两个单色器的作用，以及将光路设计成直角方向的原因。 为什么可见光分光光度计的光路是直线方向，而荧光分光光度计的光路是直角方向？,荧光分析的激发光谱和发射光谱分别提供了哪些定量分析信息？核黄素的激发光谱（实线）和发射光谱（虚线）如图所示，对核黄素进行荧光定量分析时，最佳的激发光波长和荧光波长各为多少？ 为什么？,
