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1、第十四章 核酸类药物,第一节 核酸类物质的分离提取及其发酵生产 一、RNA与DNA的提取与制备 （一） RNA的提取与制备 1.工业用RNA的提取 （1）RNA及其工业来源 从微生物中提取RNA是工业上最实际和有效的方法。 通常在细菌中RNA占5-25，在酵母中占2.715，在霉菌中占0.7%28%, 面包酵母含RNA4.17.2。 培养酵母菌体收率高，易于提取RNA，在工业上主要由RNA生产5核苷酸。,（2）高RNA含量酵母菌株的筛选 可以从自然界筛选到RNA含量高的酵母菌株，也可以用诱变育种的方法提高酵母菌的RNA含量。,糖蜜,水,糖蜜配料液,水解,水解液,中和,中和沉淀,过滤,清糖水,种
2、子,揺瓶发酵,种子培养物,种子发酵,种子发酵培养物,连续发酵,发酵液,收集菌体,酵母菌体,酵母浆,保温抽提 配料,抽提液,分离,抽提清液,酸化,酸化液,过滤,RNA,洗涤干燥,RNA干粉,磨粉包装,成品,水洗涤,发酵法生产高含量RNA酵母及其RNA提取工艺流程,（3）用工业废水培养高含量RNA酵母 减少环境污染，降低粮食消耗 （4）RNA的提取实例 啤酒酵母是提取RNA的很好的资源。 取100g压榨啤酒酵母（含水70 ），加入230ml含NaOH 3g的水，20以下搅拌30min。用6mol/L HCl调至pH7，搅拌15分钟，离心得上清液255ml。冷至10以下，6mol/L HCl调pH2
3、.5，置冷过夜，离心等RNA1.8g（纯度80）。,（二） DNA的提取与制备 1.工业用DNA的提取 取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆，加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌，升温至100 ，保温15分钟，迅速冷却至2025 ，离心去除鱼精蛋白等沉淀物，共获得35L含热变性DNA溶液。加乙醇沉淀，可得到固体DNA产品。 2.具有生物活性DNA的制备 动物内脏加4倍量生理盐水经组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500rpm离心30分钟，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次，每次洗涤后离心，将沉淀悬浮于20倍量的冷生理盐水中，再捣碎3分钟，加入2倍量5十二烷基磺酸钠，并搅拌23小时，
4、在0 2500rpm离心，在上层液中加入等体积的冷乙醇，离心即可得纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品DNA。,二、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸 （一）酶解法及碱水解法制备核苷酸 1.酶解法制备脱氧核苷酸,桔青霉或熄曲霉,液体培养2天,发酵液,压滤除菌体,酶液,酶解液,鱼精,绞肉机粉碎,鱼精匀浆,热变性 冷却，过滤,DNA溶液,加热使酶失活，调pH9.0置冷过夜，过滤,DNA降解液,吸附于氯型阴离子交换树脂分步洗脱,脱氧胞苷酸 dCMP,脱氧腺苷 dAMP,脱氧胸苷酸 dTMP,脱氧鸟苷酸 dGMP,混合，调pH,保温,2.酶解法制备戊糖核苷酸,桔青霉M843培养 产
5、生核酸酶P1,酵母提取 RNA,RNA降解成5核苷酸,阳离子树脂分离 无离子水洗涤,UMP浑浊液,除盐等杂质UMP,UMP稀溶液,UMP干粉,GMP，CMP混和液,GMP浓溶液,GMP干粉,CMP稀溶液,GMP浓溶液,GMP干粉,AMP稀溶液,AMP浓溶液,AMP干粉,流出液pH1.5,CMP溶液,2.03.5,3.54.0,3.54.5,碳柱吸附，解析,阴离子树脂,乙醇沉淀,阴离子树脂,阴离子树脂,乙醇沉淀,乙醇沉淀,乙醇沉淀,减压浓缩,3.双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（IG） 呈味核苷酸,桔青霉M843培养 产生核酸酶P1,曲霉M1197培养 产生AMP脱氨霉,RNA降解，AMP脱氨,RNA溶
6、解，调pH升温,阳树脂分离（IG）,减压浓缩,乙醇结晶,干燥,产品（IG）,4.菌体自溶法生产核苷酸,谷氨酸发酵液,离心,湿菌体,自溶,pH10,菌体自溶液,除盐,无盐提取液,离心,清液,pH3.5,阴阳离子交换树脂,单核苷酸纯化液,浓缩,浓缩液,结晶,结晶单核苷酸,5.碱水解法生产2，3混合核苷酸 RNA中的磷酸二酯键对碱性条件不稳定的特性，很容易生成2，3环状磷酸酯，水解生成2，3核苷酸。 取RNA配成33.5的水溶液，加氢氧化钠达0.3mol/L浓度，升温38C，保温16-20小时，用6mol/L盐酸中和至pH7.0，从RNA水解成2，3核苷酸降解率达95以上。 （二）发酵法生产核苷酸
7、1.发酵法生产肌苷酸（IMP） 肌苷酸钠是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠中添加2，鲜度可以增加3倍。 2.发酵法生产黄苷酸（XMP）及酶法转化成鸟苷酸 （三）半合成法制备核苷酸,三、核苷的制备 （一）RNA化学水解法制备核苷 （二）发酵法生产核苷 1.发酵法生产肌苷 2.发酵法生产鸟苷和黄苷 3.发酵法生产腺苷,第二节 核酸类药物 核酸类药物可分为两类：一类为具有天然结构的核酸类物质，有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，促进缺氧组织恢复正常生理机能。临床上用于放射病，血小板减少症，急慢性肝炎，心血管疾病，肌肉萎缩等代谢障碍。如肌苷，ATP，辅酶A，脱氧核苷酸，肌苷酸等 第二类为
8、自然结构碱基、核苷、核苷酸结构的类似物或聚合物，这一类核酸类药物是当今治疗病毒，肿瘤，艾滋病得重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物。已经正式在临床应用的8个抗病毒核苷酸类药物。,一、叠氮胸苷（AZT） （一）结构与性质 AZT治疗艾滋病的新药。化学名为3叠氮2脱氧胸腺嘧啶核苷，商品名为Refrovir。 68的病人临床表现为减轻症状，延长寿命的显著效果，常见副作用为贫血，白血球减少，部分病人骨髓坏死等。 AZT的药理作用是在体内经磷酸化后生成了3叠氮2脱氧胸腺嘧啶核苷酸，取代了正常的胸腺嘧啶核苷酸参与病毒DNA的合成，含有AZT成分DNA不能继续复制，从而达到阻止病毒增殖的目的。 （二）生产工艺,
