1CCK-8 对 LPS 诱导大鼠 TASMCs CuZn-SOD 基因表达影响的受体机制作者：董国凯, 谷振勇,马丽琴,李娜,马春玲,丛斌【摘要】 目的 探讨八肽胆囊收缩素(CCK-8)对体外脂多糖(LPS)诱导大鼠胸主动脉平滑肌细胞(TASMCs) CuZn-SOD 基因表达影响的受体机制方法 用贴块法培养大鼠 TASMCs，经 CCK-8、LPS、CR-1409、CR-2945、CCK+LPS、CR-1409+LPS、CR-2945+LPS、CR-1409+CCK-8+LPS、CR-2945+CCK-8+LPS 及溶剂单独或共同孵育细胞，用 RT-PCR 技术检测 CuZn-SOD mRNA 表达结果 对照组TASMCs CuZn-SOD mRNA 低水平表达，LPS 诱导 TASMCs CuZn-SOD mRNA 表达上调(P<0.05)，CCK-8 预处理后，LPS 对 TASMCs CuZn-SOD mRNA 表达的诱导作用可部分受抑，预先用 CR-1409（1×10-5 mol/L） 、CR-2945（1×10-5 mol/L）处理后，再分别加入 LPS 和 CCK-8，CR-1409+CCK-8+LPS、CR-2945+CCK-8+LPS 两组CuZn- SOD mRNA 表达均高于 CCK-8+LPS 组（P<0.01） ，但仍低于 LPS 组(P<0.05)，其中 CR-2945 的拮抗作用比 CR-1409 稍明显; CR-1409、2945 单独作用与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。
结论 CCK-8 通过其受体下调LPS 对 TASMCs CuZn-SOD 基因表达的诱导作用，其中 CCK-BR 较 CCK-AR 作用稍大关键词】 八肽胆囊收缩素；脂多糖；血管平滑肌细胞；CCK 受体；铜-锌超氧化物歧化酶Abstract： Objective To investigate the effect of CCK-8 receptor on LPS-induced CuZn-SOD mRNA expression in rat TASMCs. Methods Rat thoracic aorta smooth muscle cells (TASMCs) from the attachment-block culture were incubated with NS, LPS (0.1 mg/L), CCK-8 (1×10-8 mol/L), CR-1409 (1×10-5 mol/L, the specific antagonist of CCK-AR) and CR-2945 (1×10-5mol/L, the specific antagonist of CCK-BR), respectively or in combination. The expressions of CuZn-SOD mRNA were assayed by RT-PCR. Results The expressions of LPS-induced CuZn-SOD mRNA were up-regulated, compared with the control group (P<0.05). Subsequent to CCK-8 pretreatment, the induction of LPS to the expressions of CuZn-SOD mRNA in TASMCs was partially inhibited. Following pretreatment with CR-1409 (1×10-5 mol/L) and CR-2945 (1×10-5 mol/L), LPS and CCK-8 were respectively added. The expressions in CR-1409+CCK-8+LPS and CR-2945+CCK-8+LPS groups were higher than CCK-8+LPS group (P<0.01), but were still lower than those of LPS group (P<0.05). The antagonist effect of CR-2945 was slightly more evident than that of CR-1409, while either CR-1409 or CR-2945 alone had no significant differences in comparison with the control group (P>0.05). Conclusion CCK-8 can down-regulate LPS-induced CuZn-SOD mRNA 2expression in TASMCs by means of its receptors CCK-AR and CCK-BR, of which CCK-BR had slightly greater induction than CCK-AR.Key words: cholecystokinin octapeptide; lipopoly-saccharides; thoracic aorta smooth muscle cells; cholecystokinin receptor; Cu-Zn superoxide dismutase内毒素休克是严重危害人类健康的病理过程，死亡率极高。
血管调节机制紊乱是内毒素休克特征性病理改变之一，主要表现为内毒素休克发生早期主动脉压下降、肺动脉压升高在内毒素休克的发病过程中氧自由基（oxygen-derived free radicals，OFR）的生成增多与血管调节机制紊乱密切相关［1］ 八肽胆囊收缩素（cholecystokinin octapeptide，CCK-8）是一种小分子脑肠肽，通过其受体发挥调节作用，其受体属于 G 蛋白耦联受体，根据亲和力以及生物学功能的不同，分为 A、B 两种亚型，其特异性阻断剂可拮抗 CCK-8 的作用［2］ CCK-8具有明确的抗内毒素休克作用，可明显降低内毒素休克大鼠的死亡率，本实验室已有研究［3］表明，体外脂多糖(LPS)可引起培养的血管平滑肌细胞总超氧化物歧化酶（SOD）活性降低，诱导 CuZn-SOD、Mn-SOD mRNA 表达上调，而 CCK-8 可呈剂量依赖性抑制这一作用，翻转导致的 SOD 活性降低［4］ 本实验利用原代大鼠胸主动脉平滑肌细胞(thoracic aortic smooth muscle cells，TASMCs)，在以往研究基础上观察 CCK-8 对 LPS 诱导 TASMCs CuZn-SOD 基因表达的受体机制，进一步研究 CCK-8 缓解内毒素休克血管动力学紊乱的分子机制。
1 材料和方法1.1 材料 大肠杆菌脂多糖(E coli LPS)、硫酸化 CCK-8 及胰蛋白酶(Sigma公司)；DMEM 培养基(Gibco 公司)；RT-AMV(TAKARA 公司)；Trizol(北京赛百胜)；胎牛血清(北京元亨圣马公司)；MCO-175 型 CO2 培养箱(日本三洋株式会社)；其余试剂均系国产分析纯雄性、健康无热原 Wister 大鼠 55 只，(120±20)g，由河北省实验动物中心提供1.2 方法1.2.1 大鼠 TASMCs 的分离、培养和预处理 用贴块干涸法培养大鼠TASMCs大鼠经戊巴比妥钠（45 mg/kg）麻醉后，于无菌条件下迅速取出胸主动脉，放入无血清的 DMEM 培养液中，仔细剥去外膜，纵行剖开血管，轻轻刮去内皮细胞，以无血清的培养液洗 2～3 次，剪碎成 1 mm×1 mm 大小,移入培养瓶中，均匀种植于瓶底壁, 加入含 200 ml/L 胎牛血清、1×105 U/L 青霉素及 100 mg/L链霉素的 DMEM 培养基，瓶底朝上置于 CO2 培养箱中，待组织块边缘干涸后(约3.5 h)，轻轻翻转培养瓶使组织块完全浸泡于培养液中，静止 5 天，观察后换液。
细胞铺满瓶底 80% 以上时，加入 2.5 g/L 胰蛋白酶消化，1∶2 分装传代实验用 5～8 代细胞1.2.2 实验分组 CCK-8 组、LPS 组、CR-1409 组、CR-2945 组、CCK+LPS 组、CR-1409+LPS 组、CR-2945+LPS 组、CR-1409+CCK-8+LPS 组、CR-2945+CCK-8+LPS3组及对照组各组分别加入相应成分，其中 LPS 为 0.1 mg/L，CCK-8 为 1×10-8 mol/L, CR-1409 和 2945 均为 1×10-5 mol/L，对照组加等体积的生理盐水, 继续培养至相应时间后收集细胞实验独立重复 3 次1.2.3 半定量 RT-PCR 检测 SOD mRNA 表达 TASMCs 预处理 4 h,Trizol 一步法提取细胞总 RNA，严格按说明书进行操作，实验所用金属器械及玻璃器皿均经过 180℃，6 h 干烤，移液器头及 EP 管均经过 DEPC 水处理取上述总 RNA 提取液各 1 μl 行纯度与完整性的鉴定，取总 RNA 11 μl(5.5 μg)，在 AMV 逆转录酶作用下，用随机引物合成 cDNA。
根据 GenBank 中 SOD cDNA 序列(CuZn-SOD：Z21917)，用引物设计软件Primer 5.0 设计特异性引物CuZn-SOD 上游引物：5′-CAG GCA TCT TGT TCT CC-3′，下游引物：5′-AGC GAC CTC AAA CTC AC-3′(276bp)；内参对照 β-actin 上游引物：5′-GAG GGA AAT CGT GCG TGA C-3′，下游引物：5′-CTG GAA GGT GGA CAG TGA G-3′(450 bp)在含有 15 mmol/L MgCl2, 1U Taq DNA聚合酶及 20 pmol/L SOD 特异性引物的 25 μl 反应体系中,进行 cDNA 的聚合酶链反应 (PCR)PCR 循环参数为: 预变性 94℃ 3 min；变性 94℃ 45 s；复性54℃ 45 s (β-actin)， 50℃ 45 s (Cu-Zn SOD)；延伸 72℃ 45 s，进行 30 次循环后进一步延伸 72℃ 5 min取 15 μl 合成的 PCR 反应产物经 18 g/L 琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)电泳 100 V 稳压 50 min，紫外灯下观察结果、拍照，并扫描至计算机中。
用江苏捷达凝胶分析软件对电泳谱带进行半定量分析，CuZn SOD 与 β-actin 的光密度比值代表mRNA 相对表达水平(图 1)1.3 统计学处理 采用 SPSS 13.0 统计软件包进行统计分析，数据用±s 表示，组间比较行单因素方差分析(One-way ANOVA)，有显著差异者进一步用最小显著性极差法检验进行两两比较检验水准：=0.052 结果2.1 CCK-8、CR-1409 及 CR-2945 对 LPS 诱导的 CuZn-SOD mRNA 表达的影响 对照组 TASMCs 存在着 CuZn-SOD mRNA 基础表达；加入 LPS 处理 4 h，CuZn -SOD mRNA 表达明显上调，与对照组相比差异有显著性(P<0.01)；预先 30 min 加入 CCK-8，则 LPS 诱导的 CuZn-SOD mRNA 表达上调可部分抑制，与 LPS 组相比有显著差异（P<0.01） ；而预先 10 min 分别给于 CR-1409 及 CR-2945，则部分受抑的 CuZn-SOD mRNA 表达均上调，与 LPS+CCK-8 组相比差异有显著性（P<0.01） ，且 CR-2945 的上调幅度略高于。