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1、四种分子标记技术在寄生虫分类鉴定上的应用,汇报人：舒凡帆,汇报内容,1. RAPD:随机扩增多态DNA 2. AFLP：扩增片段长度多态性 3.SSCP：单链构象多态性原理 4.STRs or SSRs：微卫星,RAPD（random amplified polymorphic DNA）,1990 年William 等和Welsh 等在两个实验室同时报道了一种新的DNA指纹方法 分别取名为RAPD 和随意引物PCR。,RAPD原理,一条随即寡核苷酸引物（10bp）对总DNA进行PCR扩增，引物虽随即，但在总DNA上总会有特定位点。 1级位点 次级位点 无效位点,RAPD原理,如果2个一级位点位
2、于一条DNA链2条互补链上，呈方向重复序列，且长度小于2kb，便能扩增。,不同基因组DNA总是一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。 理论上讲，在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。,RAPD原理,RAPD 技术与PCR 技术区别,引物可随机合成和随机选定，长度一般为9- 10 个核苷酸； 随机扩增引物是单个加入，而不是成对(正、反向引物) 加入。 其次， 随机引物短，由于随机引物较短，退火温度较低，一般为35 - 45 。,RAPD优点,引物的随机性 引物的通用性 极大的探测性：可以在对物种没有任何分子生物
3、学研究的情况下，对其进行DNA多态性分析 高效性：可在短期内获得大量的多态性DNA片段，能反映整个基因组的变化 技术简单，容易掌握，不需要复杂的准备工作,RAPD缺点,稳定性差，由于单链引物随机结合在众多反向重复序列上，因而每次得到的实验结果不可能一致 高度的变异性，即使亲缘关系非常近的物种问结果也有很大差异 解链温度低的随机引物，易受到外界条件影响,AFLP分子标记技术原理,1： 不同物种的基因组DNA大小不同，基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。 2：对基因组酶切片段的选择性扩增，将获得的扩增片段通过电泳分离检测，根据带型中一些特征条带的出现或消失，检测出不同
4、扩增片段长度的多态性。,AFLP分子标记技术方法,1: 使用两种不同的限制性内切酶对整个基因组DNA进行酶切反应. 2：将所得的两端具有不同黏性末端的酶切片段与特异的人工接头在T4连接酶作用下进行连接，用作PCR扩增反应的模板。 3：用带有选择性碱基的特异引物对模板进行PCR选择性扩增，用于PCR扩增的引物的不同决定了哪些片段能够被扩增。,4：为使得扩增效果更好，反应一般分两步进行，即预扩增和选择性扩增 5：最后将获得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳再经EB染色或银染后，清晰呈现片段长度的多态性。,AFLP引物包括三部分： 5端的与人工接头序列互补的核心序列(core sequ
5、ence，CORE)， 限制性内切酶特定序列(enzyme-specific sequence，ENZ) 和3端的带有选择性碱基的粘性末(selective extension，EXT)。,使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板. 用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性. 只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增. 扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性.,AFLP优点,AFLP 结合了RFLP 的稳定性及PCR 的敏感性 不需要
6、事先知道DNA 序列资料; 稳定可靠; 可用于任何来源或复杂的目的DNA。,为什么要检测突变,1，是为弄懂人类遗传性疾病分子机制，以便有效的预防，诊断和治疗，但是更多的是用于分析不同生物基因型与表型的关联 2，对于野生型与突变体总DNA序列分析费时，昂贵，所以应该先扫描，在测序。,SSCP:单链构象多态性原理,此法的原理是: 在非变性凝胶基质中, 单股DNA 分子的电泳迁移率取决于其结构( 构象) 及大小. 由于核苷酸之间的碱基配对, 使单股DNA 分子发生二级及三级构象, 这些构象取决于单股DNA 分子的长度、碱基组成、碱基配对区的位置及数量 在最佳条件下, 即使在某一特定位置的一个碱基变化
7、亦可改变分子构象, 从而导致电泳受排阻大小不同 不同迁移率的单股DNA 带可从电泳胶上切或进行PCR 再扩增并测序, 以确定核苷酸变异。 和正常电泳图片的对比，寻找突变。,单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，当有一个碱基发生改变时，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰 胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开.,SSCP方法,取阳性PCR产物10微升 加等量的载样缓冲液(95%甲酰胺、2O mmolI EDTA、003 %二甲苯蓝、005 %溴酚蓝) 94变性5 min后立即置于冰盒中2 min复性。形
8、成一定空间结构的单链DNA分子。取35 微升混合后的样品经胶电泳810 h凝胶照片。,SSCP使用条件,质量分数5% 12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶中加入体积分数5% 10%的甘油可以提高分辨质量分数5% 12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶中加入体积分数5% 10%的甘油可以提高分辨 保持温度恒定 碱基数在200bp左右最好,SSCP局限性,只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序; 电泳条件要求较严格; 可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检. 但是百分之90的突变都可以检
9、测出来。,微卫星,微卫星DNA (mierosatellite DNA)，PCR扩增后通过产生等位基 因数目的不同长度的差异等，经过电泳，不同等位基 因之间可以发生分离。 微卫星DNA是由25个核苷酸重复序列所构 成的核心部分（重复）及侧翼序列（定位）构成 短小串连重复序列 (short tandem repeats，STR) 简单重复序列 (simple repeats sequence，SRS或SSR),重复序列很短，一般只有1 bp6 bp、长度仅为几百个bp。 在原核生物与真核生物中分布比较均匀。 随着每个重复单位碱基长度的增加微卫星位点数减少 其3种类型： 单一:(AT) n 复合型
10、: (GT)n(AT)m 间断型: 重复序列中有其它核苷酸夹杂其中，如(GT)nGG(GT)m。,微卫星DNA 两端的序列多是相对保守的，所以亲缘关系相近的物种间是保守的，而且在一些紧密相关的物种中其重复单位和重复次数具有一定的相似性。 通过核苷酸链的滑动错配或者其它未知的过程来改变它们的长度,导致微卫星突变率高。 微卫星通常是复等位（MHC）的，代表每个微卫星位点的等位基因数目高度可变。,与其他标记技术相比,Russell 等对几种分子生物学方法进行了比较，AFLP、RFLP 与RAPD 多态性片段分别为36.4%、83.2%和66.3%。 微卫星DNA 标记呈共显性的孟德尔式遗传，能够鉴别
11、杂合体，对隐性性状的选择十分有利。,微卫星突变率在不同物种、同一物种的不同位点、同一位点的不同等位基因间存在很大的差异， 但对于同物种决定相同表型的等位基因，其序列在正常情况下是衡定不变的。 同种不同等位基因之间存在着一定的差异这些差异 微卫星重复序列在物种之间具有一定的保守性,群体遗传学研究与遗传图谱的构建,1：用于基因群体流动态势，不同种族微卫星基因座（染色体上的一点或一段（越长越容易失败）等位基因的不同频率与分布就代表不同的种族。 2：微卫星DNA技术可以构建遗传图谱（同一染色体上两个基因相对距离，越远，减数分裂后共同遗传的可能越小），作用：计算遗传病概率。 3：用于动物的遗传分析来区分
12、不同 性状的家系和近交的纯合率（版纳微型猪）,法医学研究和亲子鉴定,微卫星等位基因在任何两个个体之间几乎不可能一样(同卵双胞胎除外)。 所以微卫星DNA在法医学和亲子鉴定上体现其重要价值。,动植物遗传育种和濒危野生动物的保护,群体的变异情况，比较它们之间的差异获得更丰富的基因遗传信息。优良性状的挖掘保护优良性状和品种鉴定，可选育优良品种和基因资源 了解濒危野生动物的种群结构、大小，,微卫星在日本血吸虫方面的研究,1：不同宿主的研究比较(兔，鼠，狗，猫，猪，牛，羊) 2：日本血吸虫发育不同阶段的研究比较（雌雄虫，毛蚴，尾蚴）毛蚴阶段包含所有的基因位点。 3：人工感染的尾蚴和自然条件下感染的尾蚴的
13、研究比较（野外株和实验室保存株之间的平均杂合度有极大的差异，疫苗研制的瓶颈）,微卫星DNA 位点的获得,(1) 利用已发现的微卫星位点寻找新的位点：对同属、科、目的不同物种也可以使用异种引物扩增微卫星。 （2）经典分子生物学方法克隆所需要的微卫星位点：构建DNA 文库、筛选克隆片段、测序和根据序列设计PCR 的引物以进行微卫星位点,由于毛蚴 (或尾蚴) DNA含量非常低，1个毛蚴(或尾蚴) 仅能进行单个微卫星位点研究，但具有取材方便、省时、结果可靠等优点,引物的特异性测定,LOI在所有用于检测的线虫上，均产生大小为200bp的扩增产物，说明LOI对剑属线虫来说没有任何特异性；进行的测试中，L0
14、2没有产生扩增产 IJO1产生了200bp大小的产物L02也产生了250bp大小的产物，由于L02对美洲剑线虫，亚群组外的其他线虫没有扩增产物(图4)，证明LO2引物是美洲剑线虫亚群组水平上的特异性引物,微卫星作用,1：很微量的DNA（纳克），濒危的、或只能非损伤性取样。 2：亲子鉴定，计算遗传距离，建立树状图,微卫星缺点,1：微卫星的筛选过程繁杂。目前微卫星的筛选是通过克隆和杂交技术进行的,从大量的重组质粒中筛选出合适的微卫星DNA 耗时较长、比率较低。 如684 个阳性重组质粒中筛选到8 条淡色库蚊的微卫星序列,比率为1.14 %(宋锋林,2004); 埃及伊蚊微卫星DNA 的筛选比率为3.34 %(Huber et al . , 1999) ; 多斑按蚊的筛选比率为115 %(Rongnoparut et al . ,1996) 。,需要高分辨率的检测方法,理论上最高分辨率应达到分辨出一个碱基的差别.目前常用的PAGEP银染技术，但过程复杂,这就给大样本量的检测带来了一定的难度(Huttle et al . ,1999,
