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1、分子克隆实验原理,分子克隆实验原理,一、菌种保存和活化 二、质粒提取和保存 三、感受态细胞的制备 四、载体的制备 五、基因的制备 六、连接 七、转化 八、重组克隆的筛选,菌种保存和活化,一.甘油菌保存： 1、 100 ul菌液100 ul灭菌甘油 【混匀】 2、多制备几管，做上标记【菌名，质粒，时间】 3、20 可保存半年；【80 可长期保存】 二、甘油菌活化： 1、取一管甘油菌，混匀； 2、用接种针接种并在培养平板上划线； 3、37 倒置培养12 h； 4、挑单克隆于2.5ml LB (视情况加抗生素），37 振荡培养12 h. 【注明：甘油菌用完后，最好扔掉，反复冻融易死亡。】,三种溶液：
2、 溶液1： 50 m mol/l 葡萄糖-维持渗透压，防止DNA受机械损伤降解； 25 m mol/l Tri Cl （pH 8.0)-维持 pH; 10 m mol/l EDTA (pH 8.0)-螯合Ca2+, DNase 失活，保护DNA 溶液2： 0.2 mol/ NaOH-核酸变性（pH12或pH3) (解链） 1% SDS-蛋白变性，裂解细胞。 溶液3： 7.5 mol/L NH4AC （pH 7.6) -沉淀蛋白，大分子核酸，调节pH,使小分子核酸复性（可溶）。 其它溶液： （1）2M NH4AC-沉淀蛋白，溶解核酸； (2) 异丙醇-沉淀质粒 （3）70乙醇-沉淀质粒，除去异丙
3、醇，盐分。 (4) RNase-除去细菌RNA,质粒的提取原理碱裂解法,Protocal: 1.5 ml 菌液， 12000 rpm * 1 min, 弃上清 （repeat) 收集细菌 溶液1 (200 ul), 剧烈混匀提供缓冲液 溶液2 (400 ul)，温柔混匀，冰中5 min;裂解细胞，蛋白核酸变性 溶液3 (300 ul), 温柔混匀，冰中10 min;质粒复性 13000 rpm* 5 min, 取上清；除去细菌蛋白，基因DNA 540 ul 异丙醇， 室温 10 min;沉淀质粒 14000 rpm * 10 min, 弃上清；除去可溶性杂质 100 ul 2M NH4AC 1
4、3000 rpm* 5 min, 取上清； 100 ul 异丙醇，室温10 min; 14000 rpm * 10 min, 弃上清； 70%乙醇500 ul, 14000 rpm * 10 min, 弃上清；除去异丙醇，盐分 烘干10-30 min, 除去乙醇 50 ul ddH2O (含0.1 mg/ ml RNase), 37C* 30 min.除去细菌RNA 电泳鉴定,初 抽,精 抽,除去少量杂质蛋白,质粒的保存,1.ddH2O (可含EDTA) 中可短期保存 4 保存1月; -20 可保存一年 2. 75%乙醇可长期保存. 3. 烘干可长期保存(可能难溶),感受态细胞的制备,1. 菌
5、种活化 2.取0.5ml菌液至50ml LB培养液中； 3、37 ，振荡培养2h至对数期； 4、转至50 ml无菌塑料管， 0 *10 min; 5、5000 rpm *10 min * 4 6、取沉淀，加25ml 50mM CaCl2【0 ，无菌】 7、 5000 rpm *10 min * 4 8、取沉淀, 加 2 ml 含15甘油的50 mM CaCl2重悬，200 ul/tube分装，液氮速冻后至80 冰箱保存（半年有效）。 【注意：（1）需要做一个无质粒的对照 （2）并用已知质粒转化，鉴定感受态细胞的转化效率大约106【1ug PUC 质粒，产生克隆106 】,载体的制备,1、酶切（
6、放大体积100 ul，要充分) 2、胶回收（注意远紫外照射时间不能太长，防止DNA突变） 3、纯度，浓度测定。(电泳测定）,基因的制备(*),1、PCR扩增 2. 酶切 3、胶回收 4、纯度，浓度测定,连接,1、总体积为10 ul ； 2、16 连接过夜； 3、基因mol /载体mol 10 ; 【 平端 15】,转化,1、连接产物 5 ul加入感受态细胞中； 2、混匀，冰上30min-cell 吸附DNA 3、42 , 90 s热击，促进DNA进入cell 4、冰上12min使细胞复原 5、加1ml LB (无 Amp)外源DNA还未表达 6、 37 培养1hAmp抗性基因表达 7、6000
7、rpm*30s，浓缩100ul 8、涂板（Amp板）抗性筛选 9、37 培养过夜。,重组克隆的筛选*,1、抗性筛选； 2、蓝白斑筛选； 3、酶切电泳筛选(*)； 4、PCR筛选； 5、测序验证； 6、表达筛选； 7、生物活性筛选。,抗性筛选 -质粒载体携带的筛选标记,1. AmpR （氨苄青霉素抗性） 2、TetR (四环素抗性） 3、KanR (卡那霉素抗性) 特点： 一般用抗性培养基做初级筛选，只能保证有载体转入，不能保证外源基因插入。,克隆的Amp抗性筛选,蓝白斑筛选 半乳糖苷酶（Lac Z)的显色反应,一、互补：LacZ由4个亚基构成；细菌表达一部分（无活性），载体表达一部分（无活性）
8、，合在一起构成有活性的LacZ,可分解培养基平板中的底物X-gal,生成蓝色物质。（需要IPTG诱导表达）蓝斑； 二、外源基因插入载体后，使载体部分LacZ失活，无法进行互补白斑。（） 三、特点： 1、未转入载体的细菌也会形成白斑，需同时用抗性筛选； 2、无法确定基因插入的方向； 3、特殊：基因过小，且读框正确，可能无法使载体部分LacZ失活，将产生互补，产生蓝斑。,酶切电泳筛选(*),一、选用不同的酶切组合，通过电泳检测DNA片断的大小。 二、特点： 1、可鉴定外源基因的重组和插入方向。 2、结果可靠但操作比较麻烦； 3、无法检测基因内部的突变。,EcoR1和Xho1双酶切筛选,PCR筛选,
9、1、通过特异引物扩增，电泳检测，筛选重组质粒。 二、特点： 1、可用2ul菌液做模板，快速，方便，可批量检测。 2、不能检测基因插入方向 3、不能检测基因内部突变。,测序验证,一、选取阳性克隆，送公司测序； 二、特点： 1、最可靠的检测方法。可确定基因的重组，插入的方向，基因内部的突变等。 2、价格贵，适于12个克隆的验证。,1、一次测序反应一般准确测定500bp左右(也有测准800bp,价格贵）60元左右。 2、测定的序列靠近引物（起点）2030bp不准，500bp后的序列也不准。 3、（1）质粒测序： 测序引物公司提供 （2）PCR产物直接测序： 测序引物自己提供，理论上比质粒测序更可靠。
10、 注意: A. 测序引物必须与模板完全配对；含有mix碱基的引物一般不能测序； B. 测序引物长度一般为20个碱基左右，GC含量必须在5060%左右。,测序验证,表达筛选,一、SDS-PAGE筛选； 二、亲和筛选； 三、免疫筛选；,SDS-PAGE筛选,1、小量诱导表达； 2、全菌液裂解后进行SDS-PAGE电泳； 3、重组的表达克隆将在特定的位置出现较浓的蛋白条带。（需加不诱导的对照） 特点： 1、可检测外源基因的表达。（一般基因的插入，方向，读框都正确） 2、无法筛选不能有效表达的重组质粒。,亲和筛选,1. 50 ml菌液诱导表达， 2、超声破菌， 3、用少量亲和beads吸附上清； 4、
11、SDS-PAGE检测，在特点位点将出现一条蛋白带。 特点： 1、适用于有亲和Taq的融合蛋白的检测； 2、比SDS-PAGE筛选更灵敏（富集），可靠； 3、比较麻烦。,免疫筛选,用抗体检测目标蛋白： Western blot（最准确） ELISA (可能会受到交叉反应的干扰）,生物活性筛选,酶：测定酶活； 亲和蛋白：与亲和底物作用。 其它的生物活性。,分子克隆流程,1、分析基因，载体特点； 2、设计克隆策略； 3、检测基因，载体的正确性； 4、制备感受态细胞，目的基因，载体； 5、连接，转化。 6、筛选克隆 （1）Amp抗性初筛； （2）PCR筛选（或酶切筛选）； （3）表达筛选（SDS-PAGE和亲和筛选）； （4）测序验证 （5）生物活性筛选。,
