《植物主要组织培养技术（4学时》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物主要组织培养技术（4学时（132页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第三章 植物主要组织培养技术,植物细胞工程(plant cell engineering)：就是应用植物细胞生物学的理论、方法和技术，按照设计蓝图，有计划地、大规模地培育植物细胞或组织以获得植物及其产品，或改变植物细胞的遗传组成以产生新的植物或品种，为人类生活提供更新、更好的植物产品的工程学科。,细胞工程植物细胞工程,植物组织培养(plant tissue culture)：利用植物离体器官、组织或细胞(包括原生质体)，在适宜的人工培养基上和无菌条件下进行培养，使其生长、增殖、进而发育形成小植株的方法。 狭义的组织培养往往仅指愈伤组织培养，而广义的组织培养则是指各种类型的植物无菌培养技术。现在
2、，一般的组织培养概念多是指广义概念上的组织培养技术。它包括胚胎培养、器官培养、组织培养(愈伤组织培养)、细胞培养、原生质体培养。,细胞工程植物细胞工程,第三章 植物主要组织培养技术,植物组织培养的优点 周期短，便于人工控制培养条件。繁殖速度快，经济效益高 占用空间小，不受地区、季节限制 繁殖珍稀、濒危苗木和突变体，是优良品种培育的有效途径 利于保持原来品种的特性。,细胞工程植物细胞工程,第三章 植物主要组织培养技术,植物组织培养的应用 快速繁殖：例如一株兰花一年可以繁殖到400万株。 种苗脱毒：可以有效地培育出大量的无病毒种苗。已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉等。 突变育种：可以直接诱变筛选
3、出具抗病、抗盐以及高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。 基因工程育种：基因转导后通过组织培养途径实现植株再生。 远缘杂交：利用离体受精技术和组织培养结合可以实现远缘杂交，培育一些罕见的新物种。例如苹果与梨的杂交种。,细胞工程植物细胞工程,第三章 植物主要组织培养技术,外植体(explant)：取自植物体用于组织培养的活的植物细胞或组织切段、或用于继代培养的组织培养物均称之为外植体。 继代培养(subculture)：对来自于外植体所增殖的培养物(包括细胞、组织或其切段)通过更换新鲜培养基及不断切割或分离，进行连续多代的培养，就称为继代培养。,细胞工程植物细胞工程,第三章 植物主要组织培养技术,愈
4、伤组织(callus)：愈伤组织原是指植物在受伤以后于伤口表面形成的一团薄壁细胞。在组织培养中，则是指外植体在人工培养基上诱导产生的无序生长的薄壁细胞团。 组织培养中所形成的愈伤组织与受伤时形成的愈伤组织并不完全相同，主要区别在于，在组织培养条件下，愈伤组织的形成是在外植体摆脱了母体植株的控制前提下形成的，其形成需要人工培养基为外植体提供必要的营养及生长调节物质。,细胞工程植物细胞工程,第三章 植物主要组织培养技术,植物细胞工程中心内容是植物细胞和组织的离体培养。 从技术上说它是一种从单细胞到植株的无性繁殖技术。 从遗传的角度来讲它具有双重性，一是遗传的保守性，二是遗传的变异性。利用其保守性我
5、们可以进行植物的快速繁殖，建立植物种质资源库以及生产有用化合物；利用其变异性我们可以进行体细胞诱变、体细胞杂交以及基因工程等。,细胞工程植物细胞工程,第三章 植物主要组织培养技术,第一节 植物脱毒与快繁技术,第二节 花药与花粉培养,第三节 植物胚胎培养,第四节 人工种子,细胞工程植物细胞工程,第三章 植物主要组织培养技术,3.1 植物脱毒与快繁技术,植物脱毒(virus elimination)：利用植物组织培养技术，脱除植物细胞中侵染的病毒，生产健康的繁殖材料。 离体的快速繁殖：利用细胞的再生特性，在组织培养条件下加速繁殖材料的个体生产，提高繁殖系数。,细胞工程植物细胞工程,意义,植物脱毒,
6、离体无性繁殖,细胞工程植物细胞工程,3.1 植物脱毒与快繁技术,能够有效地保持优良品种的特性 任何一个优良品种均需要有一个忠实地保存其遗传性状的繁殖方法。 离体无性繁殖由于繁殖体系是建立在体细胞系基础上，繁殖过程在人工控制的环境条件下，所以既不会造成性状分离，也不会产生退化，同时还避免了病虫害的侵染，从而可以很好的保持品种的优良特性。是异交作物和无性繁殖品种繁育的理想途径。,细胞工程植物细胞工程,3.1 植物脱毒与快繁技术,快速繁殖新品种，使优良品种迅速应用 离体繁殖因为周期短(13个月)，不受季节限制，繁殖系数高(几十几百倍)，因此其繁殖速度是任何其它方法所不能比的，所以离体繁殖又称之为快繁
7、(rapid clonal propagation)。,细胞工程植物细胞工程,3.1 植物脱毒与快繁技术,生产无病毒种苗，防止品种退化 目前受病毒危害严重影响生产的有： 大田作物：马铃薯、甘薯、甘蔗。 蔬 菜：白菜、大蒜、葱、番茄、萝卜。 果 树：柑橘、苹果、草莓、香蕉。 花 卉：香石竹、各种菊花、天竹葵、紫罗兰等。,细胞工程植物细胞工程,3.1 植物脱毒与快繁技术,节约耕地，提高农产品的商品率 块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物，每年产品用留作种的比例 。 大 蒜：留种量占产量的五到八分之一； 马铃薯：留种量占产量的十分之一； 贝 母：留种量占产量的三分之一。,细胞工程植物细胞工程,3.1 植
8、物脱毒与快繁技术,便于运输 常规的营养繁殖器官多是块根、块茎、鳞茎、枝条等，体积大、含水量高，包装、运输十分不便，特别是远距离调运损失很大。而离体繁殖的种苗体积小，一般自带容器，很易携带。运输十分方便。以马铃薯为例来讲，按一亩地4000株计算，常规薯4000个重200kg(每个50g)，若用试管薯4000个则只有1kg左右(每个100-200mg)。,细胞工程植物细胞工程,3.1 植物脱毒与快繁技术,植 物 脱 毒,基本原理,技术规程,影响脱毒效果的因素,细胞工程植物细胞工程,3.1 植物脱毒与快繁技术,基本原理： 茎尖脱毒是控制植物病毒的有效途径 ： 药物防治病毒病效率低， 抗病毒育种步履艰
9、难， 组织培养的高效隔离防治了病毒的再侵染。 脱毒保持种性快繁已是一个系统技术，在许多无性繁殖作物的种苗生产上均形成了自己的体系。,细胞工程植物细胞工程,3.1 植物脱毒与快繁技术,病毒在植物体内的分布具有不均匀性 1934年，White通过观察烟草根系，首先发现病毒在根系内的不同区域分布是不均匀的，越靠根尖区病毒含量越低，在根尖分生组织区(生长点)的顶端不含病毒。 1949年，Limasset和Cornuet根据White的发现提出，在芽的分生组织区也应存在与根尖分生组织同样的情况。 1952年，Morel和Martin首先利用茎尖分生组织培养获得了马铃薯无病毒苗，同时建立了茎尖脱毒的组织培
10、养技术体系。,细胞工程植物细胞工程,3.1 植物脱毒与快繁技术,能量竞争：病毒核酸和植物细胞分裂时DNA合成均需要消耗大量的能量，而分生组织细胞本身很活跃，其DNA合成是自我提供能量自我复制，而病毒核酸的合成要靠植物提供能量来自我复制，因而就得不到足够的能量，从而就抑制了病毒核酸的复制。 传导抑制：病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在分生组织中，维管组织还不健全，从而抑制了病毒向分生组织的传导。,细胞工程植物细胞工程,3.1 植物脱毒与快繁技术,激素抑制：在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，因而阻滞了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。或者高水平的激素浓度抑制了病毒活性。 酶缺乏
11、：1969年，Stace-Smith提出，可能病毒的合成需要酶的参与，但酶系统在分生组织中缺乏或还没建立，因而病毒无法在分生组织中复制。 抑制因子：1976年，Martin-Tanguy等提出了抑制因子假说，认为在分生组织中存在有某种抑制因子。,细胞工程植物细胞工程,3.1 植物脱毒与快繁技术,技术规程 1 被脱毒植物携带病毒的诊断 2 母体植株的选择和预处理 3 茎尖分生组织培养再生植株 4 脱毒效果检测 5 脱毒苗的保存与繁殖,细胞工程植物细胞工程,3.1 植物脱毒与快繁技术,被脱毒植物携带病毒的诊断 携带何种病毒？ 感染程度如何？,细胞工程植物细胞工程,3.1 植物脱毒与快繁技术,母体植
12、株的选择和预处理 母体材料指提供脱毒用外植物体的植株或某一器官。 母体材料的选择：块根、块茎、茎芽等 欲脱毒材料的品种典型性； 外植体健康程度选择。,细胞工程植物细胞工程,3.1 植物脱毒与快繁技术,应选择繁殖器官具有品种典型性的块根或块茎作为基础脱毒材料，其体积为中等大小，应发芽正常，无纤细芽或丛芽,在生长旺盛季节选择生长正常的顶芽作为脱毒的外植体材料,外植体预处理：,细胞工程植物细胞工程,3.1 植物脱毒与快繁技术,香石竹在3840下经两个月处理可除去全部病毒。 菊花在3538的条件下处理60天可使病毒失活。 马铃薯在37条件下处理1020天能除去卷叶病毒。 柑橘速衰病毒/黄化病毒40/3
13、0处理712周。 鳞皮病毒需要在40/30条件下处理8周。 青果病毒在50条件下处理3040分钟。,细胞工程植物细胞工程,3.1 植物脱毒与快繁技术,茎尖分生组织培养再生植株 基本过程：外植体消毒茎尖剥离茎尖培养 茎尖剥离是关键。首先用于茎尖剥离的外植体必须清洁，剥离任何可能去掉的叶片，然后浸入70%的酒精溶液中除去可能附着的空气，再进行外植体灭菌。,细胞工程植物细胞工程,3.1 植物脱毒与快繁技术,茎尖分生组织培养再生植株 利用茎尖分生组织作为外植体脱毒效果好，但不带叶原基的茎尖分生组织成苗困难，因此应确定适宜的分生组织大小。 分生组织培养形成植株后，经过生根就可移载。,细胞工程植物细胞工程
14、,3.1 植物脱毒与快繁技术,脱毒效果检测 指示植物鉴定(test plants)：所谓指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状的寄主植物。 将待测汁液接种到指示植物上，如果被测植株带毒，则指示植物上出现特定症状。 常用的指示植物有千日红、曼陀罗和心叶烟等。,细胞工程植物细胞工程,3.1 植物脱毒与快繁技术,脱毒效果检测-血清鉴定(serologic test) 试管沉淀反应：在抗原抗体最适比例条件下，观察由于沉淀产生。注意：叶绿体的自发凝聚；抗原过量会抑制沉淀形成。 免疫双扩散： 原理：抗原抗体在一定pH和离子存在的琼脂糖凝胶中相向扩散，一定时间后，两者相遇而形成不明显的抗原抗体聚合物并
15、继续扩散，当扩散至两者的适当比例时便形成大的抗原抗体复合物而出现明显沉淀，形成垂直于扩散方向的免疫沉淀线即等价线。在沉淀线两侧由于不是抗原过剩，就是抗体过剩，而不出等价线。沉淀线形成的位置与抗原抗体浓度有关，抗原浓度越大。形成的沉淀线距离抗原孔越远。 步骤：铺板、打孔（中央一个，四周若干个成梅花图形）、封底（在酒精灯上烘烤背面，使琼脂与玻璃板贴紧 ）、加样。,细胞工程植物细胞工程,3.1 植物脱毒与快繁技术,脱毒效果检测-酶联免疫吸附测定(ELISA) 原理：基于抗原抗体反应的特异性和等比例性，以96孔的聚苯乙烯塑料微孔板（又称酶标板）为载体，在适当的技术条件下使抗原或抗体包被（吸附）在酶标板
16、微孔的内壁上成为所谓的包被（固相）抗体或抗原，没有被吸附（游离）的抗原或抗体通过洗涤除去，然后直接加入酶标记抗体或抗原（或先加入适当的抗体或抗原与包被抗原或抗体反应后，再加入相应的酶标记抗体或抗原），形成酶标记的抗原抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标记物洗涤去除，加入底物溶液于微孔中，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化或还原成为有色的底物。在一定的条件下，复合物上酶的量（也反映了固定化的抗原抗体复合物的量）和酶产物呈现的色泽成正比，因此可以用分光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量。,细胞工程植物细胞工程,3.1 植物脱毒与快繁技术,脱毒效果检测ELISA 分为直接法、间接法和夹心法等几种。 直接法：直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。 间接法：是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结合形成复合后，再以
