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1、实验三 荧光光谱法测定核黄素的含量一、实验目的1熟悉 F950 型荧光光度计的使用。2掌握荧光光谱法测定核黄素含量的基本原理。二、实验原理核黄素结构式： NCH3CH3NONHOCH2OCHCH2OO分子式 C17H20O6N4，分子量 376.37。在水溶解度小，遇光分解，须避光。含有核黄素的溶液吸收光能后，能发射出荧光，在一定条件（溶液 abc0.05）下，荧光的强度与核黄素浓度成正比（I F = Kc)，能作为核黄素含量的测定方法。三、仪器和试剂10.05 mol/L H 2SO4 溶液2核黄素贮备液（25.00 g/ml） 称取 2.500 mg（在 20 万分之一天平）核黄素，移入
2、100 ml 烧杯中，以 0.05 mol/L H2SO4 溶解，移入 1000 ml 容量瓶，以 0.05 mol/L H2SO4稀释至刻度，移至棕色瓶内，冷藏，备用。3核黄素标准液（10.00 g/m1） 吸取 25.00 g/ml 核黄素贮备液 40.00 ml，移入100 ml 容量瓶中，以 0.05 mol/L。H2SO4 稀释至刻度（临用时配制） 。4仪器 F950 型荧光计、滤光片、石英比色皿四、F950 型荧光计的使用（一）仪器基本结构仪器由光源灯、聚光透镜、滤色系统、比色皿座架、光电检测器、电子系统微安表及稳压电源等部件组成。仪器的外表和旋钮如图 2 所示：图 2 F950
3、型荧光光度计主机各部分示意图1样品室 2主机电源开关 3灯电源开关 4主机电源保险丝 5灯电源保险丝样品室：样品室内部如图 3 所示，样品室盖是掀开式的；主机电源开关：开关处于 ON，电源接通；灯电源开关：开关处于 ON 时，灯电源接通；高压开关：此开关的作用是当样品室门合上时，负高压源输出负高压，光电倍增管处于工作状态。图 3 样品室1石英比色皿 2滤光片 3比色皿池 4负高压源开关（二）开机、关机操作程序1开机程序 开灯电源开关开主机电源开关开启灯电源开关后，可听到“嚓”的声音，属正常现象。在确认灯源点亮后，才可以以接着开主机电源开关，否则会对电路造成损坏。仪器所有电源打开后，进入自检程序
4、，显示区最右端翻转 l 至 5 的数字，表示自检状态。自检结束，可听到光门自动开启一次的声音，然后显示：9 280 000显示区中各部分数字表示仪器默认的功能和所处的波长，000 没有意义，只是表示是数值显示区。2关机程序 关主机电源开关关灯电源开关（三）操作步骤按 GOTO 键，指示灯亮输入波长值按 ENTER 键，寻到所需的波长；指示灯暗按 SENS 键，指示灯亮，输入灵敏度值按 ENTER 键，选择合适灵敏度；按光门 SHUT 键，指示灯暗放入样品，关闭样品室门按光门 SHUT 键，指示灯亮，显示荧光值。不进行样品测试时，需关闭光门，即 SHUT 键左侧指示灯处于暗状态。实验完毕，拿出比
5、色皿，防止样品溶液洒入样品室。五、核黄素含量的测定1标准曲线的绘制 吸取 10.00 g/ml 核黄素标准液 0.00、0.50、1.00、2.00、3.00 ml，分别置于 25 ml 比色管中各管再加 0.05 mol/L H2SO4 至刻度，摇匀。以最高浓度管定位于小于 99（调灵敏度） ，然后分别测定各标准管的荧光强度（I F(X)） ，扣除 0 管的荧光强度（I F(0)） ，即为相对荧光强度（I F(X)-IF(0)） ，以核黄素的浓度为横坐标，相对荧光强度为纵坐标作图，绘标准曲线。2样品测定 吸取 10.00 ml 样品液于 25 ml 比色管中，加 0.05 mol/L H2SO4 至刻度测其荧光强度（I F(A)） 样品的相对荧光强度应为 IF = IF(A)-IF(0)，根据 IF 值在标准曲线上查出被测样品的核黄素含量。六、思考题1核黄素的结构式中，哪些是产生荧光的基团?请在结构式中表示出来。2从理论上阐述实验结果荧光发射波长和激发光波长的相互位置关系。3解释为何要先用最高浓度调一定荧光强度，才能测试样。
