《【最新word论文】羊膜培养液体外抑制兔角膜上皮细胞血管内皮生长因子的表达【临床医学专业论文】》由会员分享，可在线阅读，更多相关《【最新word论文】羊膜培养液体外抑制兔角膜上皮细胞血管内皮生长因子的表达【临床医学专业论文】（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1羊膜培养液体外抑制兔角膜上皮细胞血管内皮生长因子的表达【摘要】目的：探讨羊膜培养液对角膜上皮细胞中血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的影响。方法：刮除并收集新鲜兔角膜上皮细胞，传代培养接种于 35mm培养皿及自制的羊膜培养皿上。实验分为 4组，组(对照组)：无血清的 DMEM培养液，组：去上皮的羊膜培养液，组：未去上皮的羊膜培养液，组：将细胞直接接种于无上皮羊膜。作用 48h后用 Trizol法提取各组样本的总 RNA,进行 RTPCR 一步法反应检测各组VEGF mRNA表达并与 actin 比较。结果：正常角膜上皮细
2、胞中有 VEGF基因表达，在，组中表达受到明显抑制（P0.01，n=5） 。结论：羊膜培养液明显抑制 VEGF mRNA在角膜上皮细胞中的表达。 【关键词】 羊膜；角膜新生血管；血管内皮生长因子；角膜上皮细胞AbstractAIM: To detect the suppression effects of culture supernatant of human amniotic membrane on the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) in rabbit corneal epithelial (RCE) ce
3、lls.METHODS: The normal RCE cells were cultured for 7 days until there were confluences on the cultures. The cells were subcultured to plastic(3 groups, was control) and naked amniotic membrane ( group) cultures respectively. Then one of plastic group ( group) was cultured by culture supernatant of
4、human amniotic membrane without epithelial layer as its medium; another plastic group ( group) was cultured by culture supernatant of human amniotic membrane with epithelial layer as its medium; the other two groups (and group) were still cultured by DMEM (free from FBS components ).After 48 hours,
5、the total RNAs of these cultures were extracted and detected by RTPCR.RESULTS:There were expressions of VEGF mRNA from group and group, however, the expressions were significantly suppressed in group(using culture supernatant of human amniotic membrane with epithelial layer as its medium) and group
6、(RCE cultered directly on naked amniotic membrane) （P0.01, n=5）.CONCLUSION: Amniotic membrane transplantation is partly through depressing the mRNA expression of VEGF in corneal cells to reduce the corneal neovascularization of injuried corneal surface. And it may be an efficient method of curing co
7、rneal neovascularization in clinic.KEYWORDS: amniotic membrane; corneal neovascularization; vascular endothelial growth factor; corneal epithelial cell0引言 2正常的角膜无血管，角膜新生血管（corneal neovascularization, CNV）常由损伤及各种炎症刺激诱导产生。严重的角膜新生血管化会导致视力下降甚至视力丧失；随着新生血管的长入，角膜的免疫赦免地位丧失。虽然目前有多种方法用于治疗角膜新生血管，但均未获得满意疗效。临床上羊
8、膜角膜移植及羊膜移植眼表重建，均显示其有抑制角膜新生血管的作用1，虽然已知羊膜的细胞外基质及可溶性细胞因子可能参与这一作用机制2,3，然而具体作用机制仍不明。最近研究表明，羊膜培养液可明显地抑制角膜新生血管化4，为进一步理解这一作用机制，我们应用可能释放多种细胞因子的羊膜培养液，对角膜上皮细胞中血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达的影响进行研究。1材料和方法1.1材料羊膜取自于健康剖腹产孕妇的胎盘，无菌条件下钝性剥离羊膜，用含有抗生素的 PBS液（1105U/L 青链霉素）清洗羊膜 3次，将羊膜上皮面向上贴附于无菌的醋酸纤维素膜上，放入 15cm的玻璃培养皿中,加入 DMEM培养基+甘油（V/
9、V，11）混合液，80 低温冰箱冷冻保存。使用时，将羊膜置于室温解冻,PBS 液水化 30min，用 2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA混合液在 37消化30min，用细胞刮刀轻轻刮除羊膜的上皮层后，用 PBS液漂洗 3次，剪成4cm4cm大小备用。将 35mm培养皿的底钻掉，消毒后备用。将剪好的去掉上皮的羊膜的基底面向上，包于 35mm培养皿上,用手术缝线固定。将羊膜为底的培养皿置于 60mm培养皿中，加入少量 DMEM培养基（含有 150mL/L胎牛血清） ，于CO2细胞培养恒温箱中过夜。取经无菌处理的新鲜羊膜，用 2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA混合液在 37消化
10、30min。以细胞刮刀将羊膜的上皮层细胞成分刮掉，将去上皮成分的 4cm4cm大小羊膜 3块浸泡于制备好的无血清 DMEM细胞培养基 30mL中。作用 48h后取其上清液待用。取经无菌处理的新鲜羊膜，保留其上皮层，将 4cm4cm大小羊膜 3块浸泡于制备好的无血清 DMEM细胞培养基30mL中。作用 48h后取其上清液待用。1.2方法兔处死后，立即将眼球取出，共 30眼。用加有双抗的生理盐水漂洗 3次，用剪刀取下透明的角膜部分，浸于生理盐水中，漂洗 1次。用手术刀片去掉角膜的内皮层，其余组织上皮面向上移入 7.5cm玻璃平皿中，加入 2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA的混合液，37下
11、消化 25min后，用刀片将角膜的上皮层轻轻刮下，离心收集上皮细胞接种到 25mL培养瓶中，以含 150mL/L FBS的 DMEM培养基培养，23d 换液 1次。培养 7d致形成融合性生长，用 2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA的混合液消化后，分别传代接种于 35mm培养皿和单纯去上皮羊膜为底物的培养皿组。用含 150mL/L胎牛血清的 DMEM培养液培养传代细胞形成 70%融合性生长后，将各组中的培养液换为无血清的 DMEM培养液继续培养 12h,以去除其它活性成分的影响。实验分为 4组，即组(对照组)：无血清的 DMEM培养液，组：去上皮的羊膜培养液，组：未去上皮的羊膜培养液，
12、组：将细胞直接3接种于无上皮羊膜。每组设 5个平行孔。12h 后，接种于 35mm培养皿的组中加入去上皮的羊膜培养上清液作为培养液,向组中加入未去上皮的羊膜培养上清液作为培养液，其余 2组仍用无血清的 DMEM培养基培养，培养 48h后，去除各样本中的多余培养液，并向每个 35mm培养皿样品中加入 Trizol提取液 1mL，最终 RNA沉淀物加入 DEPC水 20L 充分溶解，80 冷冻保存。PCR 引物由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司设计并合成,用灭菌水配成 20mol/L 的溶液,4保存。引物序列：VEGF 130bp，Sense TATTCAAGCCTTCCTGCGTG，Ant
13、isense TGAGGTTTGATCCGCAT；actin 320bp Sense GCTGTCCCTGTACGCCTCTG，Antisense TGCCGATGGTGATGACCTGG，将 RTPCR 反应产物各取 5L，加样于 20g/L浓度的琼脂糖凝胶中进行电泳，80V 电压下电泳35min。照相记录结果经扫描通过 QuantiScan分析软件处理，以内参照actin 为基准分析计算各条带的相对含量（图 1） 。2结果正常角膜上皮细胞有 VEGF mRNA表达，琼脂糖凝胶电泳分析结果显示 VEGF mRNA在无血清的 DMEM培养基培养组（组）和去上皮的羊膜培养液组（组）中均有表达，在
14、以未去上皮的羊膜培养液组（组）及单纯去上皮羊膜底物培养皿接种组（组）中表达均受到了明显的抑制（P0.01，n=5） 。3讨论角膜新生血管（neovascularization, NV）常由损伤、炎症、感染、多次角膜眼表手术及各种病理原因所致，这包括各种热化学烧伤及各种炎症刺激。随着眼表重建术的广泛开展，一些严重结角膜疾病所致眼表损伤后的角膜新生血管，已经逐渐成为困扰人们的主要问题。新生血管的形成，为创面的愈合提供了有利的条件，然而大量的新生血管在损伤愈合后，会使角膜失去其特有的光学特性，严重的角膜新生血管化会导致视力下降甚至视力丧失；新生血管的长入使角膜失去相对免疫赦免地位，增加了角膜移植手术
15、排斥反应的发生几率。目前虽有多种治疗方法，但效果均不理想。因而寻找简单、有效的治疗方法，是目前眼科面临的课题之一。临床上羊膜角膜移植及羊膜移植眼表重建，均显示其有抑制角膜新生血管的作用1，然而具体作用机制仍不十分明确。最近，我们的研究表明4，培养羊膜的上清液可明显地抑制角膜新生血管化，并观察到其可能通过抑制血管内皮细胞的生长和迁徙来抑制角膜新生血管形成。另外，Tseng 等5的一项研究显示，羊膜基质可以抑制角膜和角膜缘成纤维细胞中 TGF家族及其受体的表达，提示羊膜可以调控培养于其上角膜细胞的基因表达与行为。我们对体外培养的角膜上皮细胞研究发现，血管活化因子 VEGF在正常角膜上皮细胞中均有表
16、达，提示兔角膜上皮细胞可能参与了角膜新生血管的形成或调控。血管内皮细胞生长因子 VEGF可刺激多种血管内皮细胞的生长、增殖、迁徙移行，并刺激血管基质细胞分泌细胞外基质，刺激新生血管增生6。参与调控多种新生血管形成与增殖，如角膜新生血管化、视网膜下新生血管化的形成及在各种肿瘤的新生血管化的形成中均起着非常重要的作用。其在活跃的新生血管组织及器官，活性也明显增强。在临床中，Tseng 等5提倡使用保存的羊膜作为移植物，保存的羊膜上的上皮细胞经过反复处理其所具有的作用会大大下降，而临床羊膜移植物一般自然溶解可能需要 2wk左右。这样一段时间，羊膜细胞中产生的那些抗炎抗血管形成的物质会被消耗掉。但据临床观察，用保存的羊膜进行移植一样也可获得较好的疗效。4为了说明这种现象，我们设计了组，即将兔角膜上皮细胞直接培养在去掉上皮层的羊膜上(羊膜已冷冻保存 6mo)，考察其对角膜上皮细
