《基因操作技术-3》ppt课件

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1、1,基 因 操 作 原 理 Principles of Gene Manipulation,2,2.1.1核酸的化学结构,3,核 酸(nucleic acid),是以核苷酸为基本单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。,4,一、核酸的发现和研究工作进展,1868年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取“核素” 1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质 1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构 1965年 Nirenberg发现遗传密码 1970年 Temin和Baltimore发现逆转录酶 1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法 1985

2、年 Mullis发明PCR 技术 1990年 美国启动人类基因组计划(HGP) 1994年 中国人类基因组计划启动 2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架,5,二、核酸的分类及分布,6,第一节 核酸的化学组成及其一级结构The Chemical Component and Primary Structure of Nucleic Acid,9,嘌呤(purine),腺嘌呤(adenine, A),鸟嘌呤(guanine, G),碱 基,10,嘧啶(pyrimidine),胞嘧啶(cytosine, C),尿嘧啶(uracil, U),胸腺嘧啶(thymine, T),11,戊 糖,1

3、2,核苷：AR, GR, UR, CR 脱氧核苷：dAR, dGR, dTR, dCR,一、核苷酸的结构,13,核苷酸： AMP, GMP, UMP, CMP 脱氧核苷酸： dAMP, dGMP, dTMP, dCMP,14,电 脑 模 型图 简化式,酯键,糖苷键,15,体内重要的游离核苷酸及其衍生物,含核苷酸的生物活性物质： NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD 等都含有 AMP,多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTP,环化核苷酸: cAMP，cGMP,AMP,ADP,ATP,cAMP,16,C,G,A,17,二、核酸的一级结构,定义 核酸中核苷酸的排列顺序。 由于核苷酸间的差异主要是碱

4、基不同，所以也称为碱基序列。,18,书写方法,5 pApCpTpGpCpT-OH 3,5 A C T G C T 3,目 录,19,第二节 DNA的空间结构与功能Dimensional Structure and Function of DNA,20,DNA的二级结构-双螺旋结构 DNA双螺旋结构的研究背景和历史意义 DNA双螺旋结构模型要点 DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装 DNA的超螺旋结构 原核生物DNA的高级结构 DNA在真核生物细胞核内的组装 DNA的功能,21,一、 DNA的二级结构双螺旋结构,22,（一）DNA双螺旋结构的研究背景和历史意义,23,Chargaff 规则 任

5、何一种生物中各碱基相对比例相同 即：A=T，G=C； 不同生物的DNA,其碱基组成不同； 同一个体不同器官、组织的DNA,其碱基组成相同。 DNA双螺旋结构发现的历史意义： 揭示了生物体遗传信息储存及表达的分子机制 开创了现代分子生物学 是生物学发展史上的里程碑,24,（二） DNA双螺旋结构模型要点 （Watson, Crick, 1953）,DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，两链以-脱氧核糖-磷酸-为骨架，以右手螺旋方式绕同一公共轴盘。螺旋直径为2nm，形成大沟(major groove)及小沟(minor groove)相间。,25,（二） DNA双螺旋结构模型要点

6、 （Watson, Crick, 1953）,碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T; GC） 。 相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。,26,碱基互补配对,T,A,G,C,27,28,29,（二） DNA双螺旋结构模型要点 （Watson, Crick, 1953）,氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。,30,（三）DNA双螺旋结构的多样性,31,B-,32,33,34,35,二、DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装,（一）DNA的超螺旋结构,超螺旋结构(superhelix 或supercoil) DN

7、A双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。,正超螺旋(positive supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方同相同,负超螺旋(negative supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反,36,意义 DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。,37,（二）原核生物DNA的高级结构,原核生物DNA多为环状，以负超螺旋的形式存在，平均每200碱基就有一个超螺旋形成。,38,DNA超螺旋结构的电镜图象,39,（三）DNA在真核生物细胞核内的组装,真核生物DNA以非常有序的形式存在于细胞核内。 在细胞周期的大部分时间里，DNA以松散的染色质(

8、chromatin)形式存在，在细胞分裂期，则形成高度致密的染色体(chromosome)。,40,DNA染色质呈现出的串珠样结构。 染色质的基本单位是核小体(nucleosome)。,DNA染色质的电镜图像,41,核小体(nucleosome),由DNA和蛋白质构成 是真核生物染色体的基本单位,42,核小体的构成,核心颗粒,连接区,核心组蛋白：,组蛋白八聚体H2A、H2B、H3 、H4各2分子,DNA双螺旋分子(140bp)在核心组蛋白缠绕 1.8圈,DNA（60bp）,组蛋白H1,核小体结构图,43,44,45,核小体的折叠及染色体组装,逐级盘曲折叠,46,三、DNA的功能,DNA的基本功

9、能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。,基因从结构上定义，是指DNA分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。,47,第三节 RNA的结构与功能,Structure and Function of RNA,48,RNA的种类、分布、功能,49,一 、信使RNA的结构与功能,内含子 (intron),* mRNA成熟过程,外显子 (exon),50,* mRNA结构特点,1. 大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。,2. 大

10、多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。,51,帽子结构,52,mRNA核内向胞质的转位 mRNA的稳定性维系 翻译起始的调控,帽子结构和多聚A尾的功能,帽结合蛋白（CBPs),polyA结合蛋白(PAB),53,* mRNA的功能 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。,54,* tRNA的一级结构特点 含 1020% 稀有碱基，如 DHU 3末端为 CCA-OH 5末端大多数为G,二、转运RNA的结构与功能,55,N,N二甲基鸟嘌呤,N6-异戊烯腺嘌呤,双氢尿嘧啶,4-巯尿嘧啶,稀有碱基,5

11、6,* tRNA的二级结构 三叶草形 氨基酸臂 DHU环 反密码环 额外环 TC环,氨基酸臂,额外环,57,* tRNA的三级结构 倒L形,* tRNA的功能 活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,58,* rRNA的结构,三、核蛋白体RNA的结构与功能,* rRNA的功能 参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。,59,* rRNA的种类（根据沉降系数）,真核生物 5S rRNA 28S rRNA 5.8S rRNA 18S rRNA,原核生物 5S rRNA 23S rRNA 16S rRNA,60,核蛋白体的组成,61,四 、其他小分子RNA及RNA组学,除了上述三种RNA外

12、，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。,snmRNAs,62,snmRNAs的种类 核内小RNA 核仁小RNA 胞质小RNA 催化性小RNA 小片段干涉 RNA,snmRNAs的功能 参与hnRNA和rRNA的加工和转运。,63,RNA组学研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。,RNA组学,64,核酸和蛋白质的比较,65,核 酸 的 理 化 性 质 The Physical and

13、Chemical Characters of Nucleic Acid,第 四 节,66,67,1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA（或RNA） 20g/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0,OD260的应用,68,二、DNA的变性(denaturation),定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。,方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、 酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。,变性后其它理化性质变化：,OD2

14、60增高 粘度下降 比旋度下降 浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失,69,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,70,例：变性引起紫外吸收值的改变,DNA的紫外吸收光谱,增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。,目 录,71,热变性,解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。,目 录,72,Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(melting temperature, Tm)

15、。其大小与G+C含量成正比。,73,三、DNA的复性与分子杂交,DNA复性(renaturation)的定义 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。,减色效应 DNA复性时，其溶液OD260降低。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。,目 录,74,在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。 这种杂化双链可以在不同的DNA与D

16、NA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,核酸分子杂交(hybridization),75,76,DNA-DNA 杂交双链分子,不同来源的DNA分子,77,78,核酸分子杂交的应用,研究DNA分子中某一种基因的位置 定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础,79,探针,在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究核酸和基因诊断的新技术称为探针技术。 探针：单链的核苷酸聚合体标记后，就可以称为探针。,80,小 结,DNA的组成与结构及性质 一级：碱基序列 二级：双螺旋结构 三级：核小体、超螺旋等 RNA的组成与结构 mRNA：密码子、5帽子、3poly尾 tRNA：三叶草、倒L型结构、反密码子 rRNA：大、小亚基的组装 DNA与RNA的区别：组成