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1、第五章 荧光光谱法,当紫外光照射到某些物质的时傀这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外光停止照射时，这种光线也加之很快地消失，这种光线称为荧光。 利用某些物质被紫外光照射后所产生的、能够反映出该物质特性的荧光，以进行该物质的定性分析和定量分机称为荧光分析。,荧光分析的灵敏度一般都高过应用最广泛的比色法和分光光度法。比色法及分光光度法的灵敏度通常在千万分之几；而荧光分析法的灵敏度常达亿分之几，甚至有千亿分之几的。 荧光分析法的另一优点是选择性高。 荧光分析法还有方法快捷，重现性好，取样容易，试样需要少等优点。 荧光分析法也有它的不足之处。主要是指它比起其它方法来说应用范围还不够广泛
2、。因为有许多物质本身不会产生荧光。,第一节 荧光光谱的基本原理,荧光是分子从激发态的最低振动能级回到它原来的基态时发射的光，激发的完成是由于光的吸收。吸收与荧光密切相关，因 为吸收必须先于荧光发射。由于碰撞和热的耗散常使一部分吸收能丧失，剩余荧光的能量比吸收的能量小，因此荧光在更长的波长发射。,一、荧光的产生,如果使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所产生的的荧光通过单色器而照射于探测器上，移动单色器至各种不同波长并由探测器测得荧光强度，然后以荧光强度对照着荧光波长所绘成的曲线称为该荧光物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱。 荧光光谱表示在该物质所产生的荧光中各种不同波长组分的比较强度。,吸
3、收光谱和荧光光谱能级跃迁示意图,大多数的分子在吸收了光而被激发至第一或以上的电子激发态的各个振动能级之后，通常急剧降落至第一电子激发态的最低振动能级，在达一过程中它们和同类分子或其它分子碰撞而消耗了相当于这些能级之间的能量，因而不发出光，即无辐射跃迁。 由第一电子激发态的最低振动能级继续往下降落至基态的各个不同振动能级时，则以光的形式发出，所产生的光即是荧光,荧光光谱和吸收光谱的“镜象对称”关系,蒽的乙醇溶液的荧光光谱（右）和吸收光谱（左）,从图可看出激发光谱同荧光光谱大致成 镜相对称 a.荧光光谱(发射光谱）形状与基态S0振能级的分布情况（即能量间隔情况）有关 b. 激发光谱(吸收谱)形状与
4、激发态S1振动能级的分布有关 c. S0、S1态中振动能级的分布是相似的(说明峰形状相 似）,d. 根据Frankcondon原理，电子跃迁过程中核的相对位置不变（近似的），若吸收光谱中某一振动带的跃迁几率最大，则在荧光发射光谱中，其相反跃迁的几率也应最大(说明高峰对高峰，低峰对低峰）非镜像对称的峰出现，则表示有散射光或杂质存在。,二、产生荧光的过程和条件,荧光物质产生荧光的过程可以分为这样四个步骤： 1、处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电子激发态的各个振动能级； 2、被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子，通过无辐射跃
5、迅降落到第一电子激发态的最低振动能级；,3、降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子，继续降落到基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是荧光； 4、到达基态的各个不同振动能级的分子，再通过无辐射跃迁最后回到基态的最低振动能级。,分子产生荧光必须具备两个条件：,第一个必要条件是：该物质的分子必须具有与所照射的光线相同的频率，这与分子的结构密切有关。 产生荧光的第二个必要条件是：吸收了与其本身特征频率相同的能量之后的分子，必须具有高的荧光效率。,强荧光物质的结构特征,分子吸收辐射的能力愈强，则产生的荧光或磷光也愈强。能强烈发光的分子几乎都是通过吸收*跃迁而到达电子激发态的。因此，只有
6、那些具有共轭双键，尤其是具有刚性、平面和多环结构的分子有利于发光。,第二节 荧光效率及影响因素,一、荧光效率 表示物质发射荧光的能力 = 发射荧光分子数 / 激发分子总数 或 = 发射荧光量子数 / 吸收光量子数,Kc、kc和kx：非辐射去能量 过程的速度常数；kf和kp依 次表示荧光和磷光过程速 度常数；凡是能使kf 值升 高而使其它ki值降低的因素， 都可增强荧光。,荧光过程的量子效率f :,如kfkc和kx，f1。如kc或kxkf，则f 0。,kf , kp-决定于分子结构;kx-决定于分子结构，受环境有一定影响 Kc ，kc，-受环境影响强烈，而受分子结构影响较小,kf_强荧光物质（
7、kf值大）特征：有大的共轭双键、刚性平面多环结构、最低单重激发态S1，取代基为给电子基。这均由分子的性质和结构决定，即内因。 kf是S* S电子跃迁几率的量度。这意味着影响分子吸收带强度的因素也将影响kf，因此吸收带的最大能作kf的定性量度。当最大降低时可看到kf相应地降低。,二、荧光猝灭,广义的说，指任何可使物质荧光强度下降的 作用，任何可使荧光强度不与荧光物质的浓 度呈线性关系的作用，或任何可使荧光量子 产率降低的作用。 狭义的说，指荧光分子与溶剂分子或溶质分 子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或 化学作用过程。 荧光猝灭剂：与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度下降的物质。,1.动态
8、猝灭 猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间发生 的相互作用过程(能量转移过程等），可生成瞬 时激发态复合物（不发射荧光，或荧光的发射 特性与原先的荧光物质不同），从而引起荧光 猝灭现象。动态猝灭的效率受荧光物质激发态 分子的寿命和猝灭剂的浓度限制。1-萘胺的荧 光在碱性溶液中发生猝灭现象，但它的吸收光 谱并无变化，这是动态猝灭的一个例子。,2.静态猝灭 猝灭剂和荧光物质分子在基态时发生配合 反应，降低了荧光物质的荧光强度。动态猝灭 中的荧光量子产率由光反应动力学控制，静态 猝灭中的荧光量子产率只受基态的配位作用的 热力学所控制。,3.猝灭剂 氧能使多数荧光物质产生不同程度的荧 光猝灭现象。胺类是大
9、多数未取代的芳烃的 有效猝灭剂。 卤素化合物、重金属离子以及硝基化合 物等，也是常见的猝灭剂。卤素离子对奎宁 有显著的猝灭作用。但对某些物质却无猝灭 作用。这表明猝灭剂和荧光物质分子之间的 相互作用是有一定选择性的。,4.自猝灭 当荧光物质浓度超过1g/L时，常发生荧光 的自猝灭（浓度猝灭）现象。可能的原因： a. 荧光辐射的自吸收，这在荧光物质的吸收光谱和发射光谱有较大重叠时较严重。 b. 荧光物质的激发态分子M*与基态分子M形成激发态的二聚体（M*M）。 c. 基态的荧光物质分子的缔合。荧光自猝灭是与浓度有关的效应，因而通过在荧光测定前稀释溶液的办法，可避免这一现象的发生，或减小它所产生的
10、影响。,三、发光强度同浓度的关系,荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产 率 。If = Ia 据Beer定律：Ia = I0 - It = I0(1- e - l C) 代入上式得：If = I0(1- 10 - l c) = I0(1- e -2.3 l c) 整理得： If =2.3 I0 lc 在一定条件下： If = K c 荧光强度与荧光物质的浓度成之正比,高浓度偏离线性关系的因素： a.当浓度较浓，不满足abc0.05，公式近似处理误差大。（如果a=104 b=1.0 代入abc0.05 得c=5.010-6mol/L) b.自熄灭（Self-quenching）由荧光分子
11、间以及荧光分子同溶剂分子间的碰撞产生的。 c ，自熄灭。 c.自吸收（Self-absorption）发生在荧光发射波长同化合物的吸收峰重迭的情况下，当荧光通过溶液时便被吸收一部分。,第三节 荧光的测量,一、荧光分光光度计,激发光源 作用：提供连续辐射，激发样品 要求：光源（I0）强度足够；强度与波长无关 种类： 汞弧灯、氢灯或氙灯。 激发单色器- 作用：用于选择激发光的波长,样品池 用石英制成，形状:正方形、长方形、圆形的。低温测定时在石英液槽外套一个盛放液氮的透明石英真空瓶。 发射单色器 用于选择投射到检测器的荧光波长。 检测器 荧光或磷光的强度较弱，要求检测器灵敏度高。,二、荧光分析方法
12、,1 标准曲线法 用已知的标准物质经过和试样同样的处理后，配成一系列标液。测定标液的荧光强度，用荧光强度对标液浓度绘制标准曲线，然后根据试液的荧光强度，在标准曲线上求出试样中荧光物质的含量。,2荧光分析法的灵敏度 比吸光法高得多，更适合于低浓度物 质的分子。 这两种方法在灵敏度方面的差别主要是 由于同浓度相关的参数的测量方式不同。 在光度计中，同浓度相关的参数A是I0 、I 比的对数。在测低浓度液时，检测器必须 能区分I、I0讯号的微小差别，故在低A时 测量的精确度迅速降低。,而荧光强度F（或磷光强度P）直接同荧 光（磷光）物质的浓度成正比。同浓度相关 的参数是在很小噪声背景上的荧光（磷光）
13、发射讯号本身，可用增强入射光强度I0或增 大荧光讯号的放大倍数来提高灵敏度。而在 光度法中, 若检测器放大倍数 ，I0及I同 时， A值不变。 故荧光法灵敏度常比相应光度法高2-4个 数量级。,在光度法中，表示方法的灵敏度。， 其测定灵敏度。 在荧光法中，灵敏度与该物质激发时的及 发射时的量子效率有关。荧光法绝对灵敏 度理论定义为的乘积（单位gcm-2） , ，荧光强度，测定灵敏度。荧 光法绝对灵敏度实际定义为/H （H发射 光谱半峰宽度m-1 ） 。,一般情况下，多采用相对灵敏度来表示。相对灵敏度是以喹啉硫酸氢盐的0.05mol/L硫酸溶液为标准，并定为1，然后与相同浓度荧光物质的荧光强度比较，可求该物质的相对灵敏度。,3. 荧光分析法的选择性 很多分子在紫外可见区有吸收，但其中 只有一部分能再发射荧光或磷光，故荧光法 固有干扰很少，选择性较好。,
