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1、1改进的碱裂解法大规模提取质粒 DNA作者：王勇 袁华 刘国磊 袁玉林【摘要】 对质粒的碱裂解小量提取法进行了改进，改进的方法克服了以往质粒提取方法的 RNA 等杂质污染、操作烦琐费时、一般条件下不能大规模提取等问题，该方法操作简单、经济、实用且大规模提取，提取的质粒 DNA 得率稳定、质量好，符合大多数分子生物学常规实验的要求。 【关键词】 纯化; 碱裂解; 质粒 DNA质粒的提取作为分子生物学领域的一项基本操作技术，几乎每天都要用到。尽管现在质粒提取的试剂盒有很多，但是对于普通的实验室，特别是科研经费不够充分以及实验条件不够好的实验室，并不能实现每次都用试剂盒来大规模提取质粒。所以，采用的
2、还都是萨姆布鲁克1所提出的经典提取方法。本研究是在经典的质粒提取方法的基础上进行了一些改进，能够在简陋的实验室大规模提取质粒 DNA，该方法还克服了以往提取质粒方法的 RNA 等杂质污染和操作烦琐，且得到的质粒 DNA 的质量和纯度均符合实验的要求。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 载体和菌株 Ecoli 系 DH5 宿主菌株由本室保存;重组质粒pGenesil1(5192bp.Ampr 带有绿色荧光)和 pGenesil3(4842bp.Ampr 带有红色荧光)为靶向 IGF1 和 EGF 受体基因的小干扰 RNA 的真核表达重组质粒由本室设计和晶赛公司构建和鉴定。限制性内切酶 EcoR
3、 I 为 Promega 公司产品;Sal I为 NEW ENGLAND BioLabsinc 产品;其他常规分装分子生物学试剂均购于武汉天源生物技术公司。1.1.2 主要试剂氨苄青霉素与卡那霉素购自华美生物工程公司;其它各种堂规化学试剂均为分析纯。溶液：10mmol/L TrisHCl,pH7.5,50mmol/L EDTA, pH8.0;灭菌后，加入 RNaseA 至 20ug/ml,4保存。溶液：1%SDS，0.2mol/L NaOH;现配现用，2%SDS，0.4mol/L NaOH 母液等体积混均即可。溶液：与常规碱裂解法相同，1.32mol/L 醋酸钾，pH 4.8,用醋酸调节 pH
4、 值。灭菌后，4保存。1.2 方法1.2.1 质粒 DNA 的提取常规提取方法主要按文献1进行，但提取得到的质粒 DNA 不用 RNaseA 消化。2改进的质粒 DNA 大规模提取方法按如下步骤进行： 挑单菌于带有 Amp 抗生素的 LB 液体培养基中，37摇菌过夜，至 OD 值为 0.6，取 1.5mL 菌液 1.5mL ependorf 管中，12000g,离心 30s，弃尽上清，再重复两次，每个 ependorf 管共收集 4.5mL 菌; 加入溶液600uL，漩涡振荡器振荡，振荡使菌体充分分散，室温放置 5 min; 加入溶液600uL，轻轻颠倒 ependorf 管 45 次，使溶液
5、充分混匀，置于冰上 5 min; 加入溶液600uL，轻轻颠倒 ependorf 管 45次，使溶液充分混匀，置于冰上 15min; 12000g,4,离心 15min;吸出上清，加入 0.6 倍体积的异丙醇，轻轻颠倒振荡，充分混匀; 12000g，室温，离心15min;弃尽上清，加入 70%的乙醇洗涤沉淀一次; 超净工作台吹干沉淀或真空干燥，加入 75uL 无菌水，溶解沉淀。1.2.2 质粒 DNA 的电泳检测 采用琼脂糖凝胶电泳法1。制备 1%琼脂糖凝胶，取 2uL 样品进行凝胶电泳检测。1.2.3 质粒 DNA 的定量及杂质检测 采用分光光度计(751GW) 法2。样品释稀 20 倍后，
6、分别测定 OD260 和 OD280 值，若 OD260/OD2801.8,表明 DNA中含有 RNA 杂质。若 OD260/OD2801.6，表明样品中含有酚或蛋白质;OD260=0.1 时，相当 50ug/mL 的 DNA。2 结果与分析2.1 质粒 DNA 的电泳检测实验中采用 4842bp 和 5192bp 的小质粒 pGenesil1 和 pGenesil3 的小质粒来检测改进的质粒提取方法的重复性和适用性。从图 1 可以看出，改进质粒提取方法的得率达到标准的常规方法，且质粒 DNA 质量好，主要以超螺旋形存在;质粒 DNA 杂质明显少于常规方法所提取的质粒;最主要的是在小提取质粒条
7、件下，使用 N 个 ependorf 管可以一次性大规模提取质粒 DNA;这种改进的方法同样可以适用大质粒的提取，并且得率比常规方法略高，解决了分子量大的质粒难以提取的难题。2.2 质粒 DNA 的定量及杂质检测采用常规与改进的碱裂解法提取的 pGenecil1 和 pGenesil3 质粒 DNA，经分光光度计检测可知，改进方法提取质粒 pGenecil1 和 pGenesil3 的得率到达常规方法的水平，对于大质粒改进方法的得率更高，是常规方法的 1.2 倍。但是常规的碱裂解法提取未经 RNaseA 消化，质粒 DNA 的 OD260/OD280 比值明显增高者，表明 RNA 杂质明显减少
8、(表 1)。表 1 不同方法所制备的质粒的质量及含量 1: DNA Markers;2:来自随机 1 个菌落改进方法提取的 pGenesil1;3 5:来自随机 3 个菌落改进方法提取的 pGenesil3;6: 来自随机 1 个菌落常规方法提取的 pGenesil1;7 9:来自随机 3 个菌落常规方法提取的 pGenesil3 。图 1 质粒 DNA 的电泳检测3 讨论3质粒大规模提取早期研究工作中的实验室水平和制备及设备工艺要求高大。本研究在经典的碱裂解小提取质粒的基础上进行了改进，使碱裂解菌液过程在 N个 ependorf 管中完成。过去大多数质粒提取方法都是在最后的质粒 DNA 样品
9、中加入 RNaseA,以除去 RNA 杂质3，4，而本法直接将 RNasA 加入溶液中，在质粒的提取过程中进行 RNA 的消化，从而避免了常规方法在最后的质粒 DNA 中加入RNaseA,给样品带来人为蛋白污染;也保证了对所有样品裂解的均质性。从而使不同批次提取的质粒具有相同的质量。由于大肠杆菌不同菌株自身的特点，相同的提取方法提取的质粒会有所不同。不同的大肠杆菌细胞株会影响质粒的产量，也会影响质粒的质量或拓扑均一性，在细菌培养的过程中，由于 Amp 筛选压力的逐渐消失,不同菌株在保有质粒的性能上会有所差别，质粒会出现丢失现象。本实验中选择的挑单菌于带有 Amp 抗生素的 LB 液体培养基中，
10、菌株在质粒保有率上是最好的，也比较适合碱裂解提取质粒的方法，从质粒 DNA 的琼脂糖凝胶电泳图1 和 OD260/OD280 可以看出，在溶液预先加入 RNaseA 可以起到很好消化 RNA杂质的作用，因而节省了 RNaseA 消化样品的时间，提高了提取效率。改进的方法还省去了苯酚和氯仿抽提过程。实验结果表明，所得样品纯度与常规方法所得样品纯度相近，节省了试剂与提取时间，整个提取过程不到 1h。采用改进方法提取的质粒 DNA 干燥后，风干沉淀物有时可能产生不溶现象，依据我们经验，将沉淀物充分捣碎使其中 DNA 充分溶解，再离心，取上清。这不会造成质粒 DNA 的损失，也不会影响下游的实验。最重
11、要是在小提取质粒条件下一次性可以大规模提取质粒 DNA，达到了经济、简易、快速、效益和质量高的效果。因此文中改进提取质粒的方法快捷、经济、实用。在我们的研究中，都是采用这种改进方法提取质粒 DNA，其下游的内切酶消化、克隆、PCR、重组质粒测序鉴定、转化大肠杆菌和根瘤农杆菌等实验的结果和重复性都令人满意。【参考文献】1J 萨姆布鲁克, D W 拉塞尔. 分子克隆实验指南.黄培堂，译.北京：科学出版社, 2005.2 F M 奥斯伯(美).精编分子生物学实验指南(第 5 版).北京：科学出版社, 2008.3 义华，徐梅珍，于学平，等. 质粒 DNA 碱裂解提取法的改进. 江西农业大学学报(自然
12、科学版),2002,24(6):85153.4 姚伟,周会, 徐景升, 等. 质粒 DNA 小量提取法的改进.应用与环境生物学报,2005，11(6)：7767782 结果与分析2.1 质粒 DNA 的电泳检测实验中采用 4842bp 和 5192bp 的小质粒 pGenesil1 和 pGenesil3 的小质粒来检测改进的质粒提取方法的重复性和适用性。从图 1 可以看出，改进质粒提4取方法的得率达到标准的常规方法，且质粒 DNA 质量好，主要以超螺旋形存在;质粒 DNA 杂质明显少于常规方法所提取的质粒;最主要的是在小提取质粒条件下，使用 N 个 ependorf 管可以一次性大规模提取质
13、粒 DNA;这种改进的方法同样可以适用大质粒的提取，并且得率比常规方法略高，解决了分子量大的质粒难以提取的难题。2.2 质粒 DNA 的定量及杂质检测采用常规与改进的碱裂解法提取的 pGenecil1 和 pGenesil3 质粒 DNA，经分光光度计检测可知，改进方法提取质粒 pGenecil1 和 pGenesil3 的得率到达常规方法的水平，对于大质粒改进方法的得率更高，是常规方法的 1.2 倍。但是常规的碱裂解法提取未经 RNaseA 消化，质粒 DNA 的 OD260/OD280 比值明显增高者，表明 RNA 杂质明显减少(表 1)。表 1 不同方法所制备的质粒的质量及含量 1: D
14、NA Markers;2:来自随机 1 个菌落改进方法提取的 pGenesil1;35:来自随机 3 个菌落改进方法提取的 pGenesil3;6:来自随机 1 个菌落常规方法提取的 pGenesil1;79:来自随机 3 个菌落常规方法提取的 pGenesil3。图 1 质粒 DNA 的电泳检测3 讨论质粒大规模提取早期研究工作中的实验室水平和制备及设备工艺要求高大。本研究在经典的碱裂解小提取质粒的基础上进行了改进，使碱裂解菌液过程在 N个 ependorf 管中完成。过去大多数质粒提取方法都是在最后的质粒 DNA 样品中加入 RNaseA,以除去 RNA 杂质3，4，而本法直接将 RNas
15、A 加入溶液中，在质粒的提取过程中进行 RNA 的消化，从而避免了常规方法在最后的质粒 DNA 中加入RNaseA,给样品带来人为蛋白污染;也保证了对所有样品裂解的均质性。从而使不同批次提取的质粒具有相同的质量。由于大肠杆菌不同菌株自身的特点，相同的提取方法提取的质粒会有所不同。不同的大肠杆菌细胞株会影响质粒的产量，也会影响质粒的质量或拓扑均一性，在细菌培养的过程中，由于 Amp 筛选压力的逐渐消失,不同菌株在保有质粒的性能上会有所差别，质粒会出现丢失现象。本实验中选择的挑单菌于带有 Amp 抗生素的 LB 液体培养基中，菌株在质粒保有率上是最好的，也比较适合碱裂解提取质粒的方法，从质粒 DN
16、A 的琼脂糖凝胶电泳图1 和 OD260/OD280 可以看出，在溶液预先加入 RNaseA 可以起到很好消化 RNA杂质的作用，因而节省了 RNaseA 消化样品的时间，提高了提取效率。改进的方法还省去了苯酚和氯仿抽提过程。实验结果表明，所得样品纯度与常规方法所得样品纯度相近，节省了试剂与提取时间，整个提取过程不到 1h。采用改进方法提取的质粒 DNA 干燥后，风干沉淀物有时可能产生不溶现象，依据我们经验，将沉淀物充分捣碎使其中 DNA 充分溶解，再离心，取上清。这不会造成质粒 DNA 的损失，也不会影响下游的实验。最重要是在小提取质粒条件下一次性可以大规模5提取质粒 DNA，达到了经济、简易、快速、效益和质量高的效果。因此文中改进提取质粒的方法快捷、经济、实用。在我们的研究中，都是采用这种改进方法提取质粒 DNA，其下游的内切酶消化、克隆、PCR、重组质粒测序鉴定、转化大肠杆菌和根瘤农杆菌等实验的结果和重复
