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1、密度梯度离心法取单个核细胞,密度梯度离心法,密度梯度离心法又称为区带离心法，可以同时使样品中几个或全部组分分离，具有良好的分辨率。离心时先将样品溶液置于一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中，离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱中。,密度梯度离心法,密度梯度离心原理,不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。 介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、甘油； 密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。,密度梯度离心可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分。,密度梯度离心
2、法,也称“平衡密度梯度离心法”：用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。,蔗糖密度梯度离心法,采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。若含有沉降系数不同的许多成分，就会出现许多层。这种情况采用适当的编排
3、号码，取出样品池内的溶液，然后进行研究。这是与密度梯度离心法不同的一种沉降速度法，除了以相同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出分离物这点上是有优越性的。因多采用蔗糖密度梯度，所以亦称为蔗糖密度梯度离心法。按同样原理，也可使用分析超离心机进行测定。,分离活细胞的介质要求,1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； 2）PH中性或易调为中性； 3）浓度大时渗透压不大； 4）对细胞无毒。,密度梯度离心法应用,利用密度梯度离心的原理，用ficoll液或precoll液分离和纯化人或动物外周血单个核细胞（PBMC）。 目前比较常用ficoll密度梯度法。,Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核
4、细胞（PBMC）的实验方法,一、步骤 1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。 2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hanks液或RPMI1640 充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm20分钟。 3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hanks液， 下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。,Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)的实验方法,4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入倍以上体积的H
5、anks液或RPMI1640，1500rpm10分钟，洗涤细胞两次。 5.末次离心后，弃上清，加入含有10小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。,单个核细胞浓度(细胞数1毫升细胞悬液) 1042 （稀释倍数）,Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)的实验方法,6.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。 活细胞百分率 100 用本法分离PBMC，纯度在90以上，收获率可达8090，活细胞百分率在95以上。,Ficoll密度梯度离心法分离外
6、周血单个核细胞(PBMC)的实验方法,Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)的实验方法,二、试剂和材料 比重1.0770.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞分离液)。 Hanks液(无Ca、Mg) 10小牛血清RPMI1640 0.2台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。 肝素用Hanks液或生理盐水稀释成500单位ml，牽9凝人外周血肝素用量约为50单位1毫升血。 短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。 无菌干燥注射器针头。 血球计数板、显微镜、水平式离心机。 碘酒，75酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。,Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞
7、(PBMC)的实验方法,三、注意事项 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。 操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。 用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。,实验所需试剂的配置方法,一、Hanks液(无Ca、Mg)配制法 NaCl ： 8.0 克 KCl ： 0.4 克 NaHPO12HO ： 0.12 克 KHHPO：0.06克 葡萄糖 1.0克 双蒸水 1000毫克 1酚红液 2毫克 将上列成分混合后溶化，分装于500毫升盐水瓶内，8磅15分
8、钟灭菌，4冰箱保存，临用时调PH至7.37.6。,实验所需试剂的配置方法,二、细胞分层液配制法 9聚蔗糖 24份 34泛影葡胺 10 混合，测比重为1.0771.078，G玻璃滤器过滤除菌。冰箱保存备用。,实验所需试剂的配置方法,三、磷酸缓冲液(PB) 原液: A液: 0.2M NaHPO溶液 NaHPO 27.6克 或NaHPO2HO 31.2克 蒸馏水 溶解至 1000毫升 B液：0.2M HaHPO溶液 HaHPO12HO 71.6克 蒸馏水溶解至1000毫升 各种不同PH值PB的配法,实验所需试剂的配置方法,举例：0.1M PH7.2 PB A液 28ml B液 72ml 加蒸馏水 1
9、00ml,实验所需试剂的配置方法,四、血球保存液 葡萄糖 2.05克 枸椽酸钠 0.8克 氯化钠 0.42克 蒸馏水 100毫升 将上述成分混匀，略加温使其溶解，分装小瓶(100毫升)。经10磅、10分钟高压灭菌。4保存备用。,实验所需试剂的配置方法,五、RPMI-1640培养液 RPMT-1640(FLOW公司出品) 1袋 三蒸水 1000毫升 电磁搅拌30分钟：1N HCl调PH7.27.4(约加2.5毫升)，过滤除菌，作无菌试验，4保存。,实验所需试剂的配置方法,六、不完全RPMI-1640培养液 RPMI-1640 95毫 0.1M丙酮酸钠 1毫 0.2M谷氨酰胺 1毫升 1M Hep
10、es 1毫升 7.5 NaHCO 1毫升 青霉素、链霉素(各1万单位) 1毫升,实验所需试剂的配置方法,七、完全RPMI-1640培养液 不完全1640培养液 90毫升 灭活胎牛(或新生牛)血清 10毫升,实验补充知识,聚蔗糖泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖（商品名为Ficoll），分子量为40kD，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的Ficoll溶液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低浓度溶液，密度为1.020，添加比重为1.200的泛影葡胺（urografin）以增加密度。国外常用商品Isopaque或Hypaque，故又称Fic
11、oll-Hypaque分层液，将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合适分层液。,实验补充知识,分离人外周淋巴细胞以密度为1.0770.001的分层液最佳，因为人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个核细胞在1.0761.090之间。而不同动物血中的单个核细胞对分离液的密度要求各不相同，如小鼠为1.088，马为1.090。分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素化全血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。,实验补充知识,本法分离单个核细胞纯度可达95，淋巴细胞约占9095，细胞获得率可达80以上，其高低与室温有关，超过25时会影响细胞获得率。,
