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1、人体血红蛋白和血型的测定,实验（七）,前言,血红蛋白是红细胞的主要成分，除作为血液缓冲物质而发挥作用外，其功能是在肺部结合氧气，送到全身各组织并将组织中的二氧化碳送到肺部而呼出体外。,血红蛋白分子是一种由亚铁血红素和珠蛋白结合而成的结合蛋白，由四个亚基构成，分别为两个亚基和两个亚基。血红蛋白的贮氧、运氧功能都是依靠血红素中的Fe2+与O2的配位结合，血红蛋白与氧结合是以协同效应方式进行的。,除了运载氧与二氧化碳，血红蛋白还可以一氧化碳、氰离子结合，结合的方式也与氧完全一样，所不同的只是结合的牢固程度，一氧化碳、氰离子一旦和血红蛋白结合就很难离开，这就是煤气中毒和氰化物中毒的原理。,血红蛋白的含
2、量与年龄、性别、营养状况和生活环境等因素有关。 正常人与运动员Hb含量没有明显差异。 初生儿 170一220g/L 婴儿 160一200g/L 成年女性 110一150g/L 成年男性 120一160g/L Hb的含量对运动员的运动能力影响很大，对耐力运动员的专项素质尤为重要，因此，定期测定Hb的含量有助于了解运动员的营养、对负荷的适应及身体机能水平等情况。,实验目的 1.掌握722分光光度计的原理及操作方法； 2.了解比色法测定的原理； 3. 掌握氰化高铁血红蛋白法的原理； 4. 熟悉移液管的使用及末梢采血的方法； 5. 掌握血红蛋白指标测定的意义及在运动实践中的应用。,722分光光度计的原
3、理,光是一种电磁波，白光是由不同波长（400760nm）的电磁波按一定比例组成的混合光，通过棱镜可分解成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种颜色相连续的可见光谱。在白光的照射下，物体所以呈现特定的颜色，是因为物体对不同波长的光有选择性地吸收所致。不同物质由于其分子结构不同，对不同波长的光线的吸收能力也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。,T=I/I0 其中：T 透过率 I0 入射光强度 I 透射光强度 A 吸光度 K 吸收系数 L 溶液的光径长度 C 溶液的浓度,分光光度分析技术的原理,绿 黄 青 橙 白 青蓝 红 蓝 紫 上图对应的两边互为互补光，如将互补的色光相混即产生白光。 1. 分
4、光光度法是利用物质特有的吸收光谱来鉴定物质及其含量的方法。 2.光投射到物体上可被物体吸收或反射，如该物体是透明的则还有部分光可以透过。在白光照射下，物体所呈现特定的颜色，就是物体对不同波长的光有选择性的吸收所致。而溶液对某些波长的光的吸收极少而对其他波长的光吸收较多,则溶液就呈现这种吸收较少且透过较多光的颜色(如：硫酸铜溶液对黄光吸收最强，对蓝光吸收最弱，故在白光的照射下该溶液呈现_) ，说明任何有色溶液(或物体)都只对一种单色光有强烈的吸收能力,而对其它波长的光吸收能力较弱。,比色分析法的基本原理,比色分析法就是利用被测有色溶液吸收最强的单色光进行比色测定的，这样才能得到最满意的结果。 当
5、一束单色光通过某溶液时，溶液的吸光度A与吸光物质的浓度c及液层厚度L成正比，即溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多 。 朗伯比尔定律：O.D=KLC O.D=溶液的吸光度A （光密度） L=光径（光通过溶液的距离，既比色杯的厚度） C=样品浓度（mol/L） K=摩尔吸光系数。它表示物质的浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。其单位为L/molcm 朗伯比尔定律是比色分析方法的基本原理。,(一)人体血红蛋白的测定 实验原理,Hb被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白(Hi)，Hi与氰离子结合成氰化高铁血红蛋白(HiCN)，它在540nm有一吸收峰，测其光密度而得Hb的浓度。 Hb+K3Fe
6、(CN) 氧化 Hi Hi+CN 合成 HiCN,实验试剂和仪器,试剂： (1)HiCN稀释液（有毒） （注：高铁氰化钾法测定血红蛋白比较准确、稳定，是目前国家承认的标准，但试剂中有氰化物，剧毒，在实验进行过程中避免污染，实验完毕后注意药品的处理，不能乱倒） (2)75%的酒精 仪器： 722分光光度计、半自动生化分析仪、一次性采血装置、一次性采血管（20微升）、消毒棉球、5毫升试管、移液管,测定管（一次性试管） 氰化高铁血红蛋白稀释液5ml 酒精消毒手指，并采取新鲜血液20l 混匀后放置至少10分钟 540nm比色,空白调零读取测定管光密度值,实验操作步骤,采血部位必须无炎症、水肿、充血及循
7、环障碍。成人以无名指为宜。 被采血手指的手臂下垂1分钟左右，轻轻按摩采血部位，使其自然充血，用75酒精棉球消毒局部皮肤，待干。 紧控刺血部位，用采血针穿刺取血，动作应迅速，深度约2-3mm，轻微挤压，以血液能流出为宜。 干棉球擦去第一滴血，毛细吸管精确吸血20 l (5)采血完毕，用干棉球压住伤口，血止为止。 (6)拭净毛细管外壁血迹，加入试管中，并将毛细吸血管重复吸洗，混匀,采血的过程,1 2 3 4 5 6 7 8,1 光源 2 聚光透镜 3 色散棱镜 4狭缝 5比色杯 6 光门 7 光电管 8 检流计,722分光光度计结构示意图,722分光光度计的使用 （1）开启电源，指示灯亮，仪器预热
8、20分钟，选择开关置于“T”档 （2）旋动波长手轮，将测试所需540nm波长调节至刻度线处。 （3）打开样品室盖，调节“0%T”旋钮，使数字显示为“0.00”。 （4）以稀释液（不含待测物质的反应液）作为空白，盖上样品室盖，调节透过率“100%T”旋钮，使数字显示为“100.0”,然后将选择开关置于“A”档，用稀释液调消光零。 （5）移入待测溶液，显示值即为样品的吸光度A值。,电源开关,选择开关,722型分光光度计,波长手轮,0%T”旋钮,100%T”旋钮,比色杯（皿）,样品室,采血时，采血针应一人一针，严防交叉感染。 第一滴血弃去不用（为什么？） 3. 毛细吸管吸血时，避免气泡吸入。否则会使
9、测定结果偏低。若有气泡产生，请使用干棉签吸之 。 4. 采血时，动作应迅速，否则易发生凝血现象。 5. 配制好的HiCN稀释液中因氰化钾含量低，毒性不是很大，但仍应妥善保管。测定后的废液不能与酸性溶液混合，因为氰化钾遇酸可产生剧毒的氰氢酸气体。为防止氰化钾污染环境，比色测定后的废液集中于广口瓶中，可用除毒液除毒。,注意事项,血红蛋白（mol/L）= 测定管光密度/（摩尔吸光系数液层光程) 血红蛋白（g/L）= （测定管光密度 血红蛋白分子量）/（摩尔吸光系数液层光程) 稀释倍数 =测定管光密度（64456/44000）251 = 测定管光密度 367.7 式中： （1）64456是目前国际公认
10、的血红蛋白分子量。 （2）44000 是国际血液学标准化委员会公布的血红蛋白摩尔吸光系数。 （3）251是血样稀释倍数。,实验结果计算,Hb在运动实践中的应用： Hb指标主要用于评定某个训练周期或阶段，如根据1-2周时间内运动员对运动量和运动强度的反应来评定运动员的机能状态等。 Hb在运动训练中的变化是多因素综合作用的结果，如仅从运动负荷的影响看，大运动量训练期间系统测试血红蛋白，可能会出现以下三种类型： （1）训练初Hb下降，经一段训练后，Hb又逐步回升。 （2）训练初Hb下降，经一段训练后，始终未出现回升。 （3）训练期间， Hb无显著变化。 （1）表示运动量安排适宜；（2）、（3）则分别
11、由于运动量过大，过小而未能出现血红蛋白的正常变化趋势。因此，测试Hb的含量，对于评定运动员的机能状态和运动训练水平等具有重要的意义。,（二）ABO血型的鉴定 血型的概念：是指血细胞上特异凝集原的类型。 ABO血型的分类依据,备注：红细胞表面上含凝集原，血清中含凝集素,（一）实验目的原理： 通过用标准血型抗体对红细胞膜上ABO系统血型抗原的鉴定，掌握ABO系统定型的基本操作方法，判读技能。 根据lgM类特异性血型抗体与红细胞上特异性抗原结合能够出现凝集反应的原理。 即：凝集原与其相对应的凝集素相遇时将会发生凝集反应 例如： 凝集原A+抗A 凝集反应,ABO血型的测定,抗B血清,A 型,B 型,AB 型,O 型,抗A血清,（二）实验器材： 采血器具、玻片、玻棒、抗A抗B血型定型试剂 （三）实验步骤：（玻片法） 1.在白纸上分别注明“抗A”“抗B”字样，并放上玻片，分别滴12滴血型定型剂；,2.采血，与前一实验同期进行，用玻棒两端各蘸取12滴血分别与抗A抗B血型定型剂搅匀，定置。 3.观察是否有凝块并判断血型。,注意事项： 1、采血应采用正确的采血方法。 2、严格消毒，并保证玻片、玻棒的清洁。,根据最近所从事的运动及运动量的大小，并结合自己的专项来说明自己的实验结果，用实验结果来评定自己的身体机能状态，需要怎样去调整。若数值偏大或偏小，原因是什么？说出理由。,课后小结,
