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1、,体内药物分析,Biopharmaceutical analysis,第一章 体内药物分析概述,一、体内药物分析的定义 狭义：利用现代分析仪器和分离手段对人和动物血液、尿和组织等样品进行定性定量的分析 广义：通过体内药物浓度的分析，了解药物在体内的数量和质量的变化，获得药代动力学参数，为药品的生产、临床应用作出评价,二、体内药物分析的意义,（一）在新药评价 和开发中的意义 1全面质量控制 2新药报批 3为设计新药提供信息 从代谢产物中开发新药 保泰松羟基保泰松（作用强、副作用小） 非那西丁扑热息痛 前药设计 新剂型的研究，缓控释、经皮制剂等 以上内容必须通过测定体内药物浓度得以解决,（二）临床
2、合理用药中的意义 1血药浓度与药理作用,2. 影响血药浓度的因素,（1）机体因素 a生理因素 年龄、性别、生理状况 b病理因素 c遗传因素 （2）药物因素 a剂型因素（生物利用度问题） b药物合并使用（酶抑、酶促） c时间因素,（三）药物中毒解救的意义 （四）兴奋剂检测的意义,三、体内药物分析的对象,3从样品的来源分,1从分析物分,母体药物 代谢物 内源性物质,2从生物样品种类分,均匀样品 非均匀样品,人体 实验动物,四、体内药物分析的任务,（一）方法学的研究 （二）治疗药物监测 TDM，therapeutical Drug Monitoring 1定义 2哪些药物需进行体内血药浓度监测,有效
3、血药浓度范围窄，稍高毒性大，稍低无疗效 剂量小，毒性大的药物 个体差异大，剂量难以控制 药物毒性反应与疾病症状相似 多种药物合并应用，有中毒危险 胃肠道、肝脏、肾脏疾病 呈非线性动力学的药物 判断患者用药的依从性,（三）药代动力学的研究 （四）代谢分型的应用 （五）内源性物质测定,五、体内药物分析的特点,1干扰杂质多 2样品浓度低 3取样量少 4工作量大 5时间短 6有一定设备,六、体内药物分析的发展,1国外发展概况 60年代初 发现药效与血药浓度关系 70年代 体内药物分析方法建立 80年代至今 发展迅猛，新仪器不断涌现 书籍出版 Drug Level Monitoring 1980 The
4、rapeutical Drug Monitoring 1981 Textbook of Biopharmaceutic Analysis 1981,2国内情况,80年代初，药物分析工作者倡导，1980年版药物分析教材中纳入部分内容，第二、三版增加体内药物分析一章。第四版、第五版取消，各学校开设体内药物分析课程。 80年代开始在医院进行临床药学工作，主要测定药物浓度。,有关书籍,吴如金体内药物分析 人卫版 1984 陆明廉血药浓度测定与临床应用上海科技 1986 陈刚治疗药物监测理论与实践人民军医 1988 吴莱文治疗药物监测 人卫版 1989 曾经泽生物药物分析 北京大学出版社 1998 姚彤
5、炜体内药物分析 浙大 2001 张君仁体内药物分析 化学工业出版社 2002,3学科前沿,游离药物浓度测定 直接进样方法研究 代谢物测定 对映体分析,第二章 体内药物存在的状态与 体内药物分析的关系,一、药物的体内变化 吸收分布代谢排泄 ADME过程 发生两种变化 物理变化 可逆变化 化学变化 结构和数量发生变化,二、药物与血浆蛋白的结合,1游离型药物与结合型药物（非特异性的结合） 在血浆、组织中均存在游离型和结合型的药物 尿液中含微量P，血浆中含大量P，唾液中P为血浆1/10 与药物 结合的蛋白主要有白蛋白，a1-酸性糖蛋白、脂 蛋白 弱酸性药物主要与白蛋白结合 弱碱性药物与白蛋白、a1-酸
6、性糖蛋白结合 药物与蛋白质的结合通过共价键（氢键，离子间静电力等）,2血浆蛋白结合率 Df+P Db K= 解离常数 血浆蛋白结合率： = =,PDf,Db,Db,Db+Df,1,1+K/np+Df/np,结合力强的药物可以置换结合力弱的药物，通过竞争蛋白是药物相互作用类型之一。 由此可见，K、np是影响的重要因素 np K 药物在足够高浓度时使结合部位饱和，浓度再增高，多余的药物均呈游离状态，结合部分比率降低，药物血浆蛋白结合率是药代动力学的重要参数之一。,3血浆蛋白结合的测定 平衡透析法、超滤法、凝胶过滤法、光谱法等。 （1）平衡透析法 原理 计算 = 100% =Ct-Cf/Ct100%
7、,袋内-袋外,袋内药物,注意事项,a. 蛋白质溶液 新鲜血浆 pH7.4，至少三个浓度测定 b. 缓冲液 0.13mol/L磷酸盐缓冲液，因为Na3PO4 抑制酸性药物与蛋白质结合 c. 温度与平衡时间 37 1648h 注意防腐剂加入，药物的分解 d. 透析袋 渗漏检测 3%三氯醋酸 e. 搅拌 保持动态平衡,影响因素,a. 药物膜上吸附 b. Donnan效应 由于电荷的影响，可造成平衡时半透膜两侧游离药浓不同，donnan效应，加入中性盐可消除。 c. 空白值增加 d. 缓冲液体积变化，水分进入血浆 游离药浓 此法用于测定药物时，耗费时间太长，一般少采用,（2）超滤法,原理 计算 注意事
8、项 a装置 50l5ml，选择不同型号超滤膜，保湿。 b速度与时间 300010000r/min 515min c温度 37，25，4 影响因素 a膜吸附 b超滤液的体积 超滤液/总体积0.30.6 c超滤膜温度,三、药物与血浆蛋白结合对体内药物分析的影响,1血浆不同对体内药物分析的影响 2平衡状态不同对体内药物分析的影响 3平衡状态受破坏对体内药物分析的影响 4游离与结合同时出现时对体内药物分析的影响,四、药物代谢,1研究药物代谢的意义 了解药物在体内的命运及相互作用，保证临床用药安全 有效 研究药物代谢途径、药物结构与药理作用关系，寻找新 药 研究药物相互作用机制 有利于建立体内药物分析新
9、方法，避免代谢物干扰,2药物代谢的途径,第一相反应：在酶作用下发生的氧化、还原、水解，使极性增加，水溶性增强 第二相反应：药物或经一相反应后的代谢物与葡萄糖醛酸、硫酸盐结合等，使分子极性进一步加大，有利于从尿中排出，结合过程通常使药物灭活。,氧化反应 还原反应 水解反应 结合反应 a葡萄糖醛酸结合 b硫酸酯化 c谷胱甘肽缀合 d乙酰化结合 e氨基酸结合,五、药物代谢与体内药物分析的关系,1样品的保存 样品可能会分解，如血浆酯酶可使酯类药物水解，酶类可使药物继续代谢，加入酶抑制剂和冷藏保存。 2分析方法选择 光谱法 色谱法 免疫法 3样品的提取、分离法 代谢物极性大、水溶性强，pH缓冲系统分开
10、尿液中药物多以结合型存在，要进行水解（酸水解、酶水解，溶剂解）,第三章 生物样品的预处理,一、生物样品的采集与贮藏 体内药物分析常用的分析品种有血液、尿液、唾液，也可用乳汁、泪液、脑脊液、胆汁等。,（一）样品的采集,1血样 血样浓度与作用点的浓度密切相关，可以反映靶器官的浓度。,血细胞,血浆（plasma）,血小板,血清（serum）,血细胞,测定血样中平均分布于细胞内和细胞外的药浓,抗凝,自然,全血,血液,2尿样 目的：药物剂量回收，药物清除，药物代谢和生物利用度 特点：浓度高，易于收集，体内代谢研究，应水解分 离 3唾液 唾液中药浓与血浓相关性 收集方法 离心 收集,（二）样品的贮藏,1血
11、样（血浆、血清）及时分离冷藏， -70加入稳定 剂NaF 2尿样 尿中水、无机盐、尿素等细菌的生长， 4保存 加入防腐剂 a1%甲苯 b饱和氯仿 cpH改变 3唾液：同血样,二、生物样品的预处理,（一）预处理的目的 存在形式的多样性 游离 结合 代谢物 浓度低，杂质多（分离浓缩） 出现浑浊和沉淀 与试剂起反应 影响色谱柱寿命,（二）处理方法选择的一般原则,1药物理化性质 pKa 亲脂性 挥发性 溶解度 光谱特征 稳定性 2浓度范围 灵敏的方法 3测定的目的 定性 定量 母体 代谢 4生物样品的种类 5样品处理与分析方法的选择 专一性 灵敏性,（三）生物样品去蛋白处理,1加入与水能混溶的有机溶剂
12、及中性盐 甲醇 乙腈 甲醇1:2 乙腈1:1.5 （NH4）2SO4 NaCl 2加入酸性沉淀剂 三氯醋酸 高氯酸 苦味酸等 使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而，pH低于等电点,3组织酶消化法 加入酶使蛋白质水解 优点：平衡条件下进行，可避免反应和降解 可改善对蛋白结合率强的药物的回收率 不产生乳化 4其他 加热 超滤,（四）生物样品缀合物水解,1酸水解 2酶水解 -葡萄糖醛酸苷酶 芳基硫酸酯酶 混合酶 pH4.5-7.0 37 3溶剂解 某些药物的硫酸酯，往往加入率取溶剂时发生分解，同时提取有机溶剂中,（五）生物样品的萃取,1液-液萃取 （1）优点：与杂质分离 简便 浓集 提取率高 （2）提
13、取率：在有机相与水相中的溶解度的比值分配系数，一般少量多次，对生物样品一般一次萃取， 70%重现性,（3）影响提取率的因素 pH 碱性药物在碱性pH 酸性 酸性pH 提取溶剂 相似相溶原理 沸点低，不影响检测,性质稳定，不起化学反应 离子强度 加入中性盐 增加离子强度，与水结合强，便于有机溶剂提取,（4）离子对提取,对于离子性特强，水溶性极大的药物，可采用离子对提取 原理 应用 阴离子：COOH+ SO3H- 反离子 四丁基铵 阳离子：NH2+ 反离子烷基或芳基磺酸盐 （5）提取技术 一般在试管中进行 有机相与水相比1:1或2:1,（6）乳化问题 措施 轻缓振摇 含有分散度大或不溶物应过滤掉
14、避免在高pH条件下，从水中提取药物 避免使用易发生乳化的溶剂 萃取剂水中加入少量NaCl,破孔方法 机械法 加入少量高级脂肪醇 改变表面张力 改善混合溶剂比例，增加分散相分数,（7）药物的吸附 玻璃容器吸附 1%三甲一氯硅烷 10%二甲二氯硅烷 血浆,2液固萃取,固相萃取solid phase extraction SPE 针管式 抽空减压 加压 过滤,（1）固相萃取步骤,固相选择 样品1ml 1ml规格固相 125ml 3ml规格固相 固相处理 反相C18 固定相的610倍体积甲醇洗柱，使溶剂化 610倍水缓冲服液冲洗达分离状态 上样 分离 用适当的弱溶剂洗涤 洗去杂质，通N2干燥固相 洗脱
15、待测物 改变pH或极性,（2）影响固相萃取的因素,（1）流速 流速快，按触不充分，样品流失 回收率低 柱处理 510mlmin-1 洗脱 0.21mlmin-1（300mg 25mlmin-1（300mg） （2）装样 过载 突破性试验 已知浓度样品液 小体积上柱洗脱回收百分率 加大体积洗脱回收百分率 绘图 当回收率下降时为过载,（六）生物样品的组分浓集 （七） 衍生化处理 GC衍生化 HPLC衍生化,第四章 体内药物分析方法的建立与评价,一、分析方法,根据药物理化性质，结构特征，药物浓度，干扰成分大小，实验目的,二、分析方法的设计依据,方法的建立,原始方法改进创新 创立方法,1做好文献总结 2充分了解药物特征及体内状况 pH、亲脂性、溶解度、极性、光谱特征、药动学参数、体内代谢情况 3明确测定目的、要求 目的 4结合实验室条件 设备条件 预处理方法,药浓监测 药代动力学研究 母体药物和代谢物,三、分析方法的建立,1纯品进行测定 确定线性范围、灵敏度、反应条件（pH、t、T） 2空白样品测定 确定空白
