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1、毒理学实验基础,第一节 毒理学实验的原则与局限性 第二节 毒理学毒性实验的基本目的 第三节 实验动物 * 第四节 动物实验基本方法 * 第五节 毒理实验质量控制 第六节 动物实验的职业道德,第一节 毒理学实验的原则和局限性,一、毒理学实验的基本原则,化学物在实验动物产生的作用，可以外推于人。,一、毒理学实验的基本原则,2. 动物必须暴露于高剂量，这是发现对人潜在危害的必需和可信的方法。,3. 成年健康（雄性或雌性未孕）实验动物和人可能的暴露途径是基本的选择。选用成年健康实验动物，是为了使实验结果具有代表性和可重复性。,二、局限性,实验动物和人对外源化学物的反应敏感性不同，有时甚至存在质的差别。
2、,在毒理学实验中，为了寻找毒作用的靶器官，并能在相对少量的动物上就能得到剂量-反应或剂量-效应关系，往往选用较大的染毒剂量。,毒理学实验所选用的实验动物数量有限，那些发生率很低的毒性反应，在少量动物中难以发现。,实验动物一般都是实验室培育的品系，一般选用成年健康动物，反应较单一。,第二节 毒理学实验的目的,二、 毒性评价或安全性评价方面的其他目的,毒作用的敏感检测指标，生物标志物。 毒作用机制研究。 受试物的毒物动力学和代谢研究。 中毒的解救措施。,第三节* 实验动物（laboratory animal）,一、概述,实验动物：以科学研究为目的而进行科学饲养和繁殖的动物。,一、概述,花费人力、物
3、力较少，时间短，容易发现单因素与结果的关系。 能提供大量有价值的可与人类生命活动现象相类比的资料。 以保护人类健康来讲，需从动物身上安全，再推到人，避免对人直接损伤。,优点：,种类：常用大、小鼠，家兔和豚鼠； 有时用狗、猫、鸡和猴等。,常用实验动物的生物学和生理学指标,1.小白鼠,常用实验动物的生物学和生理学指标,常用实验动物的生物学和生理学指标,2.大白鼠,常用实验动物的生物学和生理学指标,常用实验动物的生物学和生理学指标,3.家兔,常用实验动物的生物学和生理学指标,4.豚鼠,常用实验动物的生物学和生理学指标,常用实验动物的生物学和生理学指标,常用实验动物的生物学和生理学指标,6.狗,5.地
4、鼠,二、实验动物的选择,（一）基本原则,1. 动物对受试化学物比较敏感。 2. 实验动物对受试化学物的代谢方式尽可能与人接近。 3. 经济、易获得。 4. 容易饲养和进行实验处理。 5. 自然寿命不要太长。,常用大、小鼠。,（二）种属选择,种属差异，不同实验不同毒物选不同种属动物 1. 气体、蒸汽的粘膜刺激：猫 2. 皮肤局部刺激：豚鼠、家兔 3. 过敏反应：首选豚鼠。 不同动物的致敏顺序：豚鼠家兔狗小鼠猫青蛙,4. 实质性脏器损害：大、小鼠 5. 呕吐反应：猫、狗（草食动物兔、豚鼠不呕吐） 6. 发热：兔、有时猫；大、小鼠不稳 7. 血压：狗、大鼠、家兔,8. 致癌：大、小鼠 9. 致畸：大
5、、小鼠 10.苯胺及衍生物致变性血红蛋白作用：狗猫（肉食） 黄曲酶毒素急性毒性：鸭雏 黄曲酶毒素致癌：鳟鱼 迟发性神经毒性：母鸡,不同的繁育方式可得到不同的实验动物： 品系（strain): 是实验动物学的专有名词，指用计划交配的方法，获得起源于共同祖先的一群动物。,（三）动物繁育方式的选择,纯系动物（近交系，inbred strain） 是连续“兄妹”及亲系交配达20代以上的品系，纯合性可高达98.6%，基因稳定，遗传性质一致。 优点：个体差异小，对毒物敏感一致，重现性好； 缺点：体弱多病，生殖能力低。,杂交一代（F1 hybrid） 是有目的的选择两个不同近交系进行杂交而产生的第一代。 特
6、点：杂交一代的个体间在遗传上一致，但又不是近亲，起表现型的变异频率比较低，体质健壮。,远交群（outbred colony），封闭群（closed colony）： 为避免近亲交配造成的生殖能力低，体质差等近亲衰退现象，有意识的将一个品系的动物减少近亲交配所繁殖的动物称为该品系的远交群。 如果远交群中连续5年不引进外来动物，即为封闭群。 特点：远交群以及封闭群动物的遗传均一性比近交系差，但封闭群比远交群好。,（四）微生物学等级标准选择,目前国际上通过微生物学监察手段，按对动物控制的净化程度，把实验动物分为四类，即： 级：普通动物（conventional animal , CV） 级：清洁动物
7、（clean animal , CL） 级：无特定病原体动物（specific pathogen-free, SPF） 级：无菌动物（germ free animal, GF）,实验动物设施的分类,开放系统（open system): 饲育环境与外界相同，有强力通风设施，饲料、饮水和垫料要求不被污染，应有防鼠和防昆虫设施。,2. 屏蔽系统（barrier system): 饲育环境是密闭的。送入的空气需经过滤，饲料、饮水和垫料要需经过灭菌，饲养人员要经过淋浴、穿无菌工作服、戴口罩、手套。,3. 隔离系统（isolation system): 是以一个隔离器为主体，其他客观存在附属装置组成的饲养
8、系统，送入全新风要经过滤，一切物品都要经过严格灭菌后经传递仓送入，饲养人员不得入内。,（四）微生物学等级标准选择,1.普通动物（conventional animal CV） 要求不带有人兽共患的病原体及体外寄生虫。 是实验动物中在微生物控制上要求最低的动物。饲养在开放系统的动物室内。空气未净化、喂饲全价颗粒饲料，可饮自来水。房舍要求有防鼠和防止昆虫进入的设施。人员进入要穿工作服，专用鞋帽。,2.清洁动物（clean animal CL） 在上述基础上还需不带有动物传染病的病原体。 饲养在屏蔽系统中，空气要经过净化，饲养室要保持正压，进入室内的一切物品要经过消毒灭菌，工作人员进入要洗澡和穿灭菌
9、工作服，动物饮用灭菌水。,3.无特定病原体动物（specific pathogen-free，SPF） 要求在以上基础上还需不带有干扰实验的微生物。 饲养在屏蔽或隔离系统中，是通过无菌动物、悉生动物的。笼具、饲料水要经过特殊处理，并要有严格检疫、消毒和隔离制度。,4.无菌动物（germ free animal，GF） 要求不带有任何用现代方法可检出的微生物。 此种动物在自然界中并不存在，是在隔离器中经人工剖宫产取得仔体，用无菌母体代替人工哺乳，经净化培育得到。,5.悉生动物（gnotobiotic animal，GN） 要求无菌动物中植入一种或几种已知微生物。,实验动物微生物等级标准,（五）个
10、体选择 1.年龄、体重 2.性别 3.生理状况 4.健康状况（健康动物的标志）,1)发育正常、体态丰满、外观无畸形； 2)被毛浓密、贴顺有光泽、不蓬乱； 3)胸阔宽阔、脊柱不弓不弯； 4)眼睛明亮； 5)表皮无溃疡、无结痂（注意尾巴）； 6)各天然孔干净、无分泌物； 7)行动灵活、反应敏捷。,健康状况（健康动物的标志）,三、实验动物的饲养和管理,（一）动物室：面积 地面天花板墙壁 温、湿度（20-26；50-70%） 噪声（60dB) 氨浓度（20ppm) （二）笼具 （三）饲养 （四）卫生管理,四、实验动物常见疾病,（一）大鼠和小鼠 鼠伤寒、败血症、传染性卡他、脱脚病、化脓性中耳炎、癞皮病。
11、 （二）豚鼠 豚鼠瘟、传染性肺炎、腹泻、坏血病。,第四节* 动物实验基本方法,（一）实验前动物应分开饲养。 （二）实验前动物应检疫一周，剔除不健康动物。,一、动物实验前准备,二、正式实验,（一）实验动物称重、标记、分组,1. 称重 2. 标记 染色法 用不同的颜色在动物身体的不同部位标色，代表不同的号码。 黄色苦味酸饱和溶液 个位 红色品红酒精饱和溶液 十位 耳缘剪口法 号牌法,二、正式实验,（一）实验动物称重、标记、分组,3. 分组 原则要求所有动物分配到各组的机会均等，避免主观选择倾向，使动物试验减少偏性结果准确可靠。 （1）抽签法 （2）随机数字表：完全随机和随机区组；具体参照统计学方法
12、。,染毒（administration exposure）为研究受试化学物对实验动物的毒性作用，模拟人体的主要接触途径将受试物经过某种途径进入动物体内，这种过程叫做染毒。,二、正式实验,（二）染毒方法,1. 染毒前准备,受试物的准备： 了解受试物的一般情况，如与人接触的机会、方式和量等。 了解受试物的纯度和杂质成分； 了解受试物的结构和理化性质，如分子量、比重、溶解度、挥发性、沸点、熔点和批号等； 用同一种，同一批号的受试物，一次备齐全部实验用量； 按选用的染毒途径不同，将受试物配成一定的剂型。,1. 染毒前准备,溶剂或助溶剂的选择： 所有溶剂或助溶剂均应无毒； 与受试物不起反应，受试物在溶液
13、中稳定； 不影响毒物的吸收，（不妨碍或促进）；,1. 染毒前准备,剂型的选择： 喂饲法要求受试物无特殊气味或味道，性质应比较稳定，不容易分解氧化； 灌胃法要求为液体，并且无明显的局部损伤或刺激作用； 静脉注射法一般用水溶液，不能用油溶液或混悬液； 腹腔注射法不能用混悬液以免引起腹腔脏器粘连； 呼吸道染毒要求受试物在染毒柜中能均匀稳定分布的气体； 经皮染毒要求为液体、膏状或糊状。,2. 各种染毒途径,经口染毒 经呼吸道染毒 经皮染毒 注射途径,2. 各种染毒途径：经口染毒,灌胃 喂饲 胶囊吞服,2. 各种染毒途径：经呼吸道染毒,定义：在一定容积的密闭容器内，加入一定量的毒物使之挥发并与容器内空气
14、充分混合，均匀分布，形成一定浓度的含毒空气环境，放入毒物，在规定的时间内观察动物的毒性反应。,静式吸入染毒,染毒装置：一般采用特制的机玻璃染毒柜或大的玻璃瓶。,注意事项： a.液态受试物不能滴漏到染毒柜底，以防粘上动物皮肤被动物舔食。 b.设计的最高染毒浓度不能超过该受试物的蒸气饱和浓度，以免受试物蒸发不全而达不到设计要求。,动式吸入染毒,定义：是采用机械通风装置，连续地将新鲜空气和毒物送入染毒柜，并排出等量的污染空气，使染毒浓度相对稳定。,染毒装置：由三部分组成 a.染毒柜 b.机械通风系统 c.配气系统,静态染毒柜,动态染毒柜,静式染毒与动式染毒的优缺点比较,2. 各种染毒途径：经皮肤染毒
15、,）备皮：机械脱毛、化学脱毛 脱毛区体表面积15% ）染毒方法 浸尾 涂皮,2. 各种染毒途径：经注射途径,腹腔注射； 肌肉注射； 静脉注射； 皮下注射；,（三）生物材料的采集,1. 血液的采集,剪尾采血； 眼眶静脉丛采血； 眼球摘除采血； 断头采血； 心脏采血； 股动脉采血； 耳缘静脉采血； 腹主动脉采血；,（三）生物材料的采集,2. 尿液和粪便的采集,代谢笼,第五节 毒理学实验质量控制,人事方面。 实验动物。 实验仪器和设备。 实验应有严格的标准化操作程序和要求。 受试物的完整资料。 实验记录。 实验室工作人员。,GLP：good laboratory practice 优良实验研究规范
16、SOP：standard operating procedure 标准操作方法,第六节 动物实验的职业道德,3R原则（Replace；Reduction；Refinement） 替代（Replace）：应用无知觉材料的科学方法来代替使用活的有知觉脊椎动物的方法； 减少（Reduction）：是指在能够保证获取一定数量与精确度的数量信息的前提下，减少动物的使用数量； 优化（Refinement）：在必须使用动物时，要尽量减少非人道程序的影响范围和程度。,实验动物 实验动物的选择 基本选择原则 种属选择 动物繁殖方式的选择 微生物标准选择 个体选择,健康动物的标准 染毒 标记的方式 常见染毒方式经口染毒 动式吸入染毒与静式吸入染毒 常用采血方法,
