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1、南方医科大学2010级博士学位论文麻黄石膏药对配伍的化学成分、药效及代谢组学研究Study on chemical constituents，pharmacological effectsand metabonomics of Traditional Chinese Herb Pair,Ephedra and Gypsum课题来源：麻黄类药对组成规律的基础研究(国家自然科学基金，编号81030066)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院梅芬罗佳波教授中药学学术型博士研究生中医药学院2013年5月22日广州博士学位论文麻黄石膏药对配伍的化学成分、药效及代谢组学研究博士研究生：梅芬指
2、导老师： 罗佳波教授摘要研究背景药对又称“对药”、“对子药”、“姐妹药”，由两味药成对，个别由三味以上药组成，是临床上常用的相对固定的配伍形式。药对的配伍是中药复方配伍的最简单、最基本和最常见的形式，其以一定证候特点及采用相应治法为前提，根据药物的性味归经、升降浮沉，选择性地将两味中药进行配对，其配伍蕴涵着丰富的客观规律。本课题为麻黄类药对组成规律的基础研究(国家自然基金重点项目)的部分研究内容。麻黄石膏药对是中医临床常用的药对之一，在很多经典方剂中都有运用，例如麻杏石甘汤、越婢汤等，现代常用于感冒、支气管肺炎、支气管哮喘等属表邪未尽，热邪壅肺等证。本课题选择经方麻杏石甘汤及其“主药对麻黄石膏
3、药对为研究对象，以2味药的配比量为切入点，将麻黄石膏药对的配伍研究分解为1)药对配伍前后的体外化学成分变化研究；2)主要药理效应(毒性)比较研究； 3)药对配伍对对代谢组生物信息的干预研究；4)综合分析麻黄石膏药对配伍、化学成分变化与药理效应改变三者间的相互关系。研究目的本研究以经典的寒热配伍药对麻黄石膏为研究对象，运用现代技术手段，从化学成分变化、量效关系、药理效应改变、体内代谢途径与机制等方面对麻摘要黄石膏药对进行较为全面和系统的研究，通过分析麻黄石膏药对不同比例配伍中指标性成分的含量、药效作用及代谢组学等方面的差异，可以寻求其发挥作用的最佳配伍比例，找出其量效、时效以及毒效间的关系，从而
4、有利于更好地发挥药物的疗效，并可进一步验证、深化麻黄石膏药对“相使”的配伍关系，据此为麻黄石膏药对配伍的制剂研究及其临床应用，提供工作基础和实验依据。研究方法伤寒论中麻杏石甘汤组成为：“麻黄四两(去节)；杏仁五十个，去皮尖；甘草二两，炙；石膏半斤。本实验选取麻杏石甘汤中的药对麻黄一石膏(1：2)为研究对象，依据药对文献报道的配比上下成倍浮动，设计成三个配比1：1、1：2、1：4三个配伍组。1麻黄石膏药对不同配伍配比的体外化学成分研究建立测定麻黄石膏水煎液中麻黄类生物碱的HPLC方法并进行了精密度、稳定性、加样回收率等方法学考察；采用玎?LC测定麻黄、麻黄石膏药对1：1、1：2、1：4三个配伍配
5、比水煎液中麻黄类生物碱(去甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱、麻黄碱、伪麻黄碱和伪麻黄碱)的含量并比较麻黄石膏不同比例配伍前后水煎液中5种生物碱含量的变化。利用钙离子试剂盒测定各组水煎液中的钙离子并比较了麻黄石膏不同比例配伍对Ca2+溶出的影响。采用反相高效液相色谱法，选用Cosmosfl C1 8柱(250mmx46mm，5岬)，流动相为乙腈01磷酸水溶液(含01-7_,胺)进行梯度洗脱，分析并确定了麻黄石膏不同比例配伍水煎液的“共有峰”，并研究了不同比例配伍对“共有峰”的影响。2麻黄石膏药对不同比例配伍的主要药理效应研究急性毒性研究 昆明小鼠，雌雄各半，分为麻黄、麻黄石膏(1：1)、麻黄-石膏(1
6、：2)、麻黄-石膏(1：4)5个给药组，每组分别设5个剂量组(n_10)，根据预实验确定的Dn、Dm，定出相邻两组剂量比，组间比值为1：O8。实验时将依博士学位论文据“低比稀释法”配制不同浓度的药液灌胃给予相应的小鼠。灌胃前禁食不禁水12小时，灌胃后观察饲养7 d，观察小鼠的精神、活动、饮食、大小便、死亡等情况。记录各组动物中毒症状及死亡情况。记录实验结果，并用Bliss软件计算LD50值和95置信区间。解热作用研究采用干酵母混悬液诱导雄性SD大鼠发热模型，选取体温合格大鼠，随机分为随机分为19组，即空白对照组、模型对照组、阿司匹林组、麻黄高中低剂量组、石膏高中低组、麻杏石甘汤组、麻黄石膏(1
7、：1)高中低低剂量组、麻黄石膏(1：2)高中低剂量组、麻黄石膏(1：4)高中低组，每组6只，灌胃给药(正常对照组和模型对照组均给予等容积蒸馏水)，给药后每小时测量肛温一次，连续测量三次。计算各给药组8h对大鼠体温升高抑制率()。利用Calcusyn统计软件(Biosoit，USA)分析麻黄石膏两者的相互作用。平喘作用研究采用卵蛋白诱导的哮喘大鼠模型，将60只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、地塞米松组、麻石1：2(高、中、低)剂量组、麻黄石膏(1：1)组和麻黄石膏(1：4，单味麻黄组、石膏组共10组，每组6只。观察麻黄、石膏配伍前后对大鼠引喘潜伏期、肺干湿重、EOS、WBC计数影响。3麻黄石
8、膏药对不同配伍干预干酵母诱导热病症候的代谢组学研究“发热”大鼠模型的建立及其代谢组学研究将12只雄性Wistar大鼠随机分为2组(n_6)，空白对照组和模型组(背部皮下注射20酵母混悬液10mLkg造模)，将大鼠(正常对照组，模型组)置于代谢笼中收集6 h尿液，尿液直接衍生化。采用G CMS联用技术测定各组大鼠尿液代谢物谱。运用XCMS工具箱对代谢物谱进行峰识别、峰对齐和去噪等处理，得到由保留时间、样品号及信号强度组成的三维矩阵，将矩阵导入模式识别软件SimcaP 120(瑞典，Umetrics AB，Umea)进行主成分分析(PCA)、偏最d-乘法判别分析(PLSDA)。PLSDA的结果中列
9、出各变量的变量重要性值VIP(Variable Importance in the Projection)，根据VIP大小排列，其中VIP值大于1的变量被认为是变化明显且对区分贡献较大，作为标记物分析，通过与气质工作站的数据库、对照品及查询网站进行对比分析，选择匹配度较高的内源性生物标志物作为鉴定结果。摘要麻黄石膏对“发热”大鼠的代谢组学研究将雄性Wistar大鼠随机分为5组，即空白对照组、模型组、麻黄组、麻黄石膏1：2组和石膏组，每组6只。除空白组外，大鼠背部皮下注射20干酵母(1 0mLkg大鼠体重)造模，各给药组分别在造模后6 h灌胃给药一次，收集给药后6 11尿液，对空白组、模型组、麻
10、黄组、麻黄石膏1：2组和石膏组的尿液代谢轮廓进行主成分分析(PCA)和PLSDA分析，对其特征抽提及模式识别。选择VIP值大于1的物质作为干酵母诱导发热模型的潜在特异性生物标志物，通过与气质工作站的数据库、对照品及查询网站进行对比分析，选择匹配度较高的内源性生物标志物作为鉴定结果。分析麻黄组、麻黄石膏1：2组和石膏组生物标志物的差异及水平变化，结合现有的生物化学知识阐释麻黄、石膏药对配伍前后的调节机制。实验结果1麻黄石膏药对不同比例配伍的体外化学成分研究麻黄石膏药对不同比例配伍对麻黄类生物碱含量的影响 水煎液中5种生物碱(去甲基伪麻黄碱、去甲基麻黄碱、麻黄碱、伪麻黄碱和伪麻黄碱)含量的变化实验
11、结果显示，除麻黄石膏(1：4)配伍组中的去甲基麻黄碱含量比单味麻黄组降低(P麻黄石膏(1：1)麻黄石膏(1：4)。解热实验结果与模型组相比，麻黄组、麻黄石膏(1：1)组、麻黄石膏(1：2)组、麻黄石膏(1：4)组均具有解热作用，且呈一定的量效关系。各给药组8h抑制率()从大到小排列为：麻石1：2高剂量组(627)、麻杏石甘汤全方组(597)、麻黄高剂量组(590)、麻石1：2中剂量组(536)、麻黄中剂量组(494)、麻石1：1高剂量组(477)、麻石1：4高剂量组(472)、麻石1：1中剂量组(431)、麻石1：4中剂量组(371)、石膏高剂量(330)、麻石1：1低剂量组(308)、麻石1
12、：4低剂量组(284)、麻石1：2低剂量组(217)、麻黄低剂量组(216)、石膏中剂量(109)、石膏低剂量(46)。通过比较麻黄石膏药对3个配比解热的作用时间与作用强度，我们发现麻黄石膏(1：2)的解热作用最佳，解热持续时间最长。麻黄石膏(1：2)在解热方面具有协同增效作用。平喘作用结果麻石1：2高、中剂量组均能延长引喘潜伏期(PI,it would be taken as potential metabolic markerThedifferences of potential biomarkers levels in different groups were conducted wi
13、thtmivariate statistical analysis using software of SPSS 1 30，and those with significantdifference were chosen as final biomarkersMetabonomics study on yeast-induced-fever rats after administration with withdifferent compatibility ratio Ephedra-Gypsum extracts：30 WLstar rats were randomlydivided int
14、o normal control group，model group，Ephedra-Gypsum(1：2)group，Ephedra group and Gypsum groupThe fevered rats were prepared bY subcutaneousinjection of 20yeastThen 6h urine of rats in each group were collectedAll theurine samples were derivatized directlySubsequently,metabolites spectra of thesesamples
15、 were acquired using gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)Identification after processed，the data Was subjected to SIMCA-P+1 20soffware(Umetrics AB，Umea Sweden)for principal component analysis(PCA)andprincipal least squares discriminant analysis(PLS-DA)The modeling and therapeuticeffects were
16、judged by PCA visually：distinguishing effect among groups were fultherinspected by PLS-D八and the correlation with classification of metabolites wereevaluated according to thevariable impotance in the projection(VIP)”valueWhena certain metaboliteS VIPI，it would be taken as potential metabolic markerThedifferences of potential biomarkers levels in different groups were conducted wi
