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1、 生物技术综合实验甘薯-谷氨酰半胱氨酸合成酶(-GCS)基因的克隆和原核表达学生： 学号： 同实验者： 谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧化应激作用, 保护细胞膜的完整性等。-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶, 可以调控GSH的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用, 说明-GCS也与植物抗逆过程密切相关。实验一 甘薯叶片RNA提取一、实验目的 1. 了解真核生物RNA提取的原理； 2. 掌握Trizol提取的方法和步骤。2、 实验原理 Trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速
2、抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿
3、抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总 RNA中蛋白质和DNA污染很少。3、 实验材料1. 材料 甘薯（Ipomoea batatas Lam）叶片，品种为徐薯182. 试剂 无RNA酶灭菌水：加入0.01%的DEPC，处理过夜后高压灭菌； Trizol试剂； 氯仿； 异丙醇、75乙醇； TBE缓冲液； 上样缓冲液（6）3. 仪器高压灭菌锅、微量移液器、台式离心机、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、1.5mL塑料离心管、枪头和EP管架4、 实验方法1. 将叶片取出放入研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100 mg植物叶片加入1
4、 mL Trizol试剂，室温放置5 min，使样品充分裂解； 2. 每1 mL Trizol试剂加入200 L氯仿，用手剧烈振荡混匀后室温放置3-5 min使其自然分相；3. 4 12,000 rpm 离心15 min，吸取上层水相转移到新管中；在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置15 min；4. 4 12,000 rpm 离心10 min，弃上清，RNA沉淀于管底；5. RNA沉淀中加入1 mL 75%的乙醇（用RNase-free水配制），温和震荡离心管，悬浮沉淀； 4 8,000 rpm离心2 min，弃上清；6. 室温放置10 min晾干沉淀；7. 沉淀中加入20L RNase
5、-free ddH2O，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70保存；8. 用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用EB染色并照相。5、 实验结果1. RNA提取结果 依照Trizol试剂盒方法，提出的RNA较少，此部分未以图或数据显示。2. RNA后电泳结果 如图1. 其中9a为本组实验结果。由图可知RNA条带非常模糊，拖尾现象严重，几乎无法分清具体条带，亮度较大。点样孔附近的红色部分为杂质，在提取过程中并未很好除去。图1. RNA提取跑胶结果。其中1泳道为样品Marker，9a泳道为本小组RNA样品。与标准对照可见条带模糊，拖尾现象严重。6、 分析与讨论1. RNA的提取 产量并不多，可能是因裂解样品
6、不充分或RNA沉淀未完全溶解所致。在实验过程中，由于对操作时间的掌握不熟练、操作技巧不完善，留上清与弃上清时令RNA损失了部分，使最终RNA产量不理想。2. RNA电泳结果有EB存在时，电泳后28S rRNA和18S rRNA在紫外灯下应看得很清楚，另出现条由tRNA，5.8S rRNA和5S rRNA组成的较模糊、迁移较快的带。如果RNA没有降解，则28S rRNA的亮度应为18S rRNA的2倍，且这两条带都无弥散现象发生。由图1. 9a可知，RNA拖尾现象严重，说明RNA已大部分被降解；此外点样孔附近出现红色部分杂质，分析可能有并未除尽的蛋白质，同样影响RNA电泳结果。在进行实验时，本小
7、组成员未严格戴上口罩并勤换手套，这可能使外源RNAase进入样品，导致其降解严重。另外，提取出RNA后本小组未立即将样品放入-70保存，也为导致结果不理想的重要原因之一。在最初用氯仿萃取分层的过程中，由于水相吸取过多，掺杂入部分蛋白质杂质而未于后续纯化步骤除尽，RNA条带拖尾严重可能还受该蛋白质影响。7、 总结：本次试验RNA提取非常失败，从跑胶结果可见其降解严重。虽然大实验无法避免试剂交叉污染的可能性，且电泳用胶的质量也会影响实验结果，但从图1. 2a，3a，2b等条带较为清晰的小组实验结果可知，琼脂糖凝胶质量以及试剂对结果干扰不大。那么本小组成员在提取过程中的操作一定出现了很大失误。首先口
8、罩、手套应该严格按规定佩戴，提取过程对移液枪等仪器使用需谨慎仔细，尽量避免混入杂质。其次为排除部分杂质影响可对RNA样品用紫外线分光光度计测定吸光值检验，将有助于结果分析。最后，细节决定成败，我们应汲取教训避免接下来的实验出现类似问题。实验二 第1链cDNA的合成和模板的验证1、 实验目的1. 掌握第1链cDNA的合成方法和步骤2、 实验原理 真核生物基因多为断裂基因，编码区不连续，需经转录后加工才能成为成熟mRNA。以真核成熟mRNA为模板合成cDNA，进而获得有连续氨基酸编码的DNA序列，无需转录后加工，即可在原核细胞中表达。 真核生物的mRNA都有PolyA尾巴。引物：Oligo dT（
9、12-18个T）。莫洛尼氏鼠白血病毒逆转录酶（M-MLV ）以单链RNA为模板，在引物的引发下合成与模板互补的DNA链（cDNA）。 mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR，RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。三、实验材料1. 材料 徐薯18叶片RNA样品2. 试剂 dNTP mixture（10 mM each）； Oligo (dT) Primer (10 M)； Total RNA； RNase free ddH2O； M-MLV 反转录酶； 5First-strand
10、Buffer； 0.1 M DTT； Ribonuclease Inhibitor (40 U/L)3. 仪器10L 和100L 的移液枪、0.5mL的EP管、PCR仪等4、 实验方法1. 在RNase free Microtube 管中配制下列混合液：dNTP mixture（10 mM each） 1 L*Oligo (dT) Primer (10 M) 4 LTotal RNA 2 LRNase free ddH2O up to 12 L2. 将混合物65 C加热5 min，迅速在冰上冷却2 min，快速离心，然后加入下列成分：5First-strand Buffer 4 L0.1 M
11、DTT 2 LRibonuclease Inhibitor (40 U/L) 1 L3. 将混合物轻轻混匀，37温浴2 min；4. 加入M-MLV反转录酶（200U/L）1 L，用枪头轻轻吹打混匀；5. 37温浴50 min；6. 70 加热15 min，使反转录酶失活，所得反转录产物可直接用于PCR反应。附 反转录模板的看家基因的验证（-actin）引物primerssequencessizeIbActinF IbActinR5-TTCCCCGGTATTGCGGATAGAATG-35-CGGACCGGACT CATCATACTCTG -3 198bp以第一链cDNA为模板，-actin-F
12、和-actin-R为引物，使用Taq酶进行PCR。 表1 -actin PCR 反应体系（25L体系） DNA模板1L(约50 ng)10PCR缓冲液(Mg2+ plus)2.5L Mg2+2.5L10 mol/L TPS -F1 L10 mol/L TPS -R1L2.5 mmol/L dNTP2.5L Taq 酶0.2 L灭菌去离子水15.3 L合计25 L* PCR反应条件 30个循环94 2min95 30sec 62 30sec 6830sec最后，1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增产物。5、 实验结果1. -actin验证 如图1. 其中编号1为Marker，3为本小组RNA样品-act
13、in验证结果。由图可知，使用RNA模板通过RT-PCR得到了长度为198bp类似条带，但因产物浓度较低，该条带不甚清晰，并有部分弥散现象发生。 图1. -actin验证电泳结果。其中编号1为Marker，编号3为本小组RNA样品经RT-PCR在加入引物IbActinF 、IbActinR后扩增出的-actin产物。6、 分析与讨论1. RNA提取因实验一本小组RNA提取失败，故此实验采用老师准备的RNA进行验证。2. -actin验证结果如图1. 第3组为本小组验证结果。其中-actin能被cDNA模板扩增出，但条带模糊并有拖尾现象出现。首先，因所得产物量较少，故电泳条带模糊，推测可能是在进行
14、RT-PCR前，RNA有部分降解或于操作过程中损失部分所致。其次，本实验在对-actin产物进行电泳后结果出现拖带，可能原因主要有：1）cDNA第一链产物的含量过高；2）DNase降解DNA产生的寡核苷酸有非特异性扩增；3）PCR反应中引物过多；4）循环次数过多；5）退火温度过低；6）Taq酶过多；7）Mg2+浓度不合适。综合本次试验分析，因实验条件已预先经过尝试，故导致拖带的最可能因素应为cDNA降解产生了寡核苷酸非特异性扩增片段。由于照片清晰度欠佳，非特异性扩增片段无法清晰显示，但若与图2. 进行对比则可发现第2组-actin验证图出现了非特异性扩增片段。 图2. 第2组-actin验证图。其中1为Marker，编号2、6可见清晰的两条带。 若要进行改进，则需尽量提取高质量RNA，防止其被DNA污染。另外进一步优化PCR反应条
