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1、1外周血 MUC1 基因表达与食管癌微转移的关系作者：施舜缤，俞力超，胡嘉波，朱孝中，许文荣【关键词】 食管癌; 黏蛋白; 微转移; 逆转录聚合酶链反应1 资料与方法1.1 病 例无转移组:选择 2006 年 1 月至 2006 年 5 月我院病理确诊为食管鳞癌而经 B超、CT 或术中探查未发现有远处转移的患者 53 例。转移组:同一时期病理确诊为食管鳞癌，又经 B 超、CT 或术中探查明确发现有远处转移的患者 10 例。良性对照组:同一时期的食管炎 7 例,贲门失弛症 2 例,食管烧伤 1 例。1.2 标本采集和处理无转移组、对照组所有患者于采集标本前均未行任何针对肿瘤的治疗,采外周血(采集
2、标本均需肝素抗凝),先抽出 1 ml 弃去,再留取 5 ml。红细胞裂解液裂解红细胞， 分离有核细胞，液氮速冻后，-80保存备用。1.3 方 法采用 Trizol 试剂提取细胞总 RNA, 所提 RNA 经 1琼脂糖电泳鉴定。以 1 g 为模板,以 OligodT 作引物,置于 70温浴 5 min 后,冰浴 2 min,再加入逆转录酶、dNTP 等,在 42温浴 1.5 h 合成 cDNA, 94灭活逆转录酶及预变性 5 min，以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。MUC1 基因引物设计序列如下2,3(外引物 A 和 B,内引物 C 和 D,产物分别为 510 bp，287 bp) A:
3、5ATGCCAGTAGCACTCACCATAG3 ；B:5CAGCCAAGGCAATGAGATAGAC3;C:5CGTCGTGGACATTGATGGTACC3 ；D: 5GGTACCTCCTCTCACCTCCTCCAA3 。 肌动蛋白作为内对照标准,引物序列E:5TCATCACCATTGGCAATGAG3 ；F:5CACTGTGTTGGCGTACAGGT3 ，产物为 154 bp。引物均由上海生工生物工程技术服务公司合成。巢式 RTPCR 扩增条件：第 1 次，94 90 s 后,94 15 s，55 30 s，68 45 s 循环 35 次；68终延伸 5 min，扩增产物 510 bp。第
4、 2 次，94预变性 90 s，94 15 s，55 30 s，72 30 s，循环 30 次；72终延伸 2 min。配制 1.8%琼脂糖凝胶,产物电泳,经溴化乙啶(EB) 显色得到特异性条带者为阳性检出。1.4 统计学分析应用 SPSS11.0 软件进行统计分析，采用 2 检验, P0.05 为有差异有统计学意义。22 结 果2.1 总 RNA 鉴定经过 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,18 S 和 28 S 条带清晰可见，见图 1。2.2 各组之间阳性率比较以 肌动蛋白的 RTPCR 扩增产物量为依据，调整巢式 RTPCR 模板量，标本 MUC1 表达结果见图 2。良性对照组 10 例外周血中无
5、 MUC1 mRNA 阳性表达。无转移组 MUC1 mRNA 阳性检出率为 39.6%(21/53),转移组 MUC1 mRNA 阳性检出率90.0%(9/10),结果见表 1，各组间差异有统计学意义(2=6.66, P0.05)。结果见表 2。表 2 无转移组术前外周血中 MUC1 mRNA 检测阳性分布与病理分化程度的关系（略）2.4 食管癌患者阳性表达与国际 TNM 分期的关系MUC1 mRNA 阳性率随 TNM 分期升高而升高。但，期之间相比检出率差异无统计学意义(P0.05)；而期与，期相比阳性检出率差异有统计学意义(P0.05)。见表 3。3 讨 论肿瘤微转移一般指恶性肿瘤细胞播散
6、于淋巴结、骨髓、外周血及其他组织器官中，尚未形成转移性结节,无任何临床表现，常规方法难以发现和检测到的转移4，5 。肿瘤临床转移一般都由微转移发展而来，对肿瘤微转移的检测是临床判断治疗效果、预示肿瘤复发的有效手段。有关食管癌的微转移研究起步较晚,一般局限于食管癌淋巴结的微转移方面6，7 。外周血液的微转移研究较少，有证据表明食管癌患者外周血循环中也存在肿瘤细胞，提示食管癌患者并非中晚期才发生血性转移8，9 。早期发现肿瘤微转移对肿瘤的分期、复发、预后有重要的意义。表 3 食管癌患者术前外周血中 MUC1 mRNA 检测阳性分布与国际 TNM 分期的关系（略）常规 RTPCR 技术一般 1 ml
7、 全血中含有 100 个肿瘤细胞以上时才可能被检测出。采用巢式 RTPCR 技术,即用两对引物进行两轮 RTPCR 扩增,第 2 对引物序列在第 1 对引物扩增的 RTPCR 产物片段内,那么灵敏度可提高到 1 ml 全血中含有 1 个肿瘤细胞就能被检测出10 。我们应用巢式 RTPCR 技术检测了53 例食管癌患者术前外周血标本,发现 MUC1 mRNA 阳性率为 39.6%(21/53)，已经发生临床转移的食管癌患者阳性率为 90.0%(9/10)；不同病理分化程度之间阳性检出率无统计学意义，可能与病例数较少有关；MUC1 mRNA 阳性率随 TNM 分期升3高而升高，期与，期相比阳性检出
8、率有差异有统计学意义(P0.05)。阳性率与生存率之间的关系正在随访之中。而良性对照组无一例 MUC1 mRNA 阳性,提示该方法具有较高的特异性。Kimura 等11的研究表明,血液中微转移食管癌肿瘤细胞的出现是一个独立预后因素，检测微转移肿瘤细胞具有重要意义。外周血液标本较易获得,可反复取样,动态观察。但应该考虑到外周血采血时间、部位、血量、时间间隔等对检测结果有一定影响。微转移肿瘤细胞进入血液的释放规律、阳性检出率与肿瘤转移及复发的相关性还有待于进一步研究和探讨。【参考文献】1Yoshioka S,Fujiwara Y,Sugita Y,et al.Realtime rapid reve
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