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1、1基质金属蛋白酶 9 在哮喘大鼠中性粒细胞中的表达作者：金微瑛，叶辉，童夏生，王恩智，郭海渊，阮正英 金小红【摘要】 目的:观察基质金属蛋白酶 9(MMP-9)在哮喘大鼠血中性粒细胞(PMN)中的表达，探讨 PMN能否通过合成 MMP-9参与哮喘的发病。方法：健康雄性 SD大鼠 30只，随机分成哮喘组（A 组） 、布地奈德治疗组（B 组）和正常对照组（C 组） ，用卵蛋白（OVA）致敏和激发的方法建立哮喘模型。分离纯化血PMN，免疫细胞化学法检测 MMP-9的表达水平，ELISA 法检测血清基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）的浓度。结果：A 组（0.1960.011，OD 值）PMN M
2、MP-9的表达水平显著高于 C组（0.1000.010，OD 值） （P 0.01） ，B 组（0.1350.008，OD 值）PMN MMP-9的表达水平显著低于 A组但高于 C组（均 P 0.01） 。A 组血清 TIMP-1为(34.964.54 )ng/mL，表达水平显著高于 C组的(26.143.43) ng/mL（P 0.01） ，B 组血清 TIMP-1的表达水平显著低于A组但高于 C组（P 0.05 或 P 0.01） 。MMP-9 与 TIMP-1的表达水平呈显著正相关(n =29，r=0.713，P 0.01)。结论：哮喘大鼠 PMN合成 MMP-9的功能增加，PMN 可能
3、部分通过增加合成 MMP-9参与哮喘的发病，这种功能可以部分被布地奈德所抑制。 【关键词】 哮喘；MMP-9；TIMP-1；PMN；大鼠Abstract: Objective: To observe the expressions of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in blood polymorphonuclear leukocyte (PMN) of asthmatic rats. And to approach whether PMN could participate in asthma pathogenesis through synthes
4、izing MMP-9. Methods ：Thirty rats were randomly divided into three groups on average， including asthmatic group (group A)， budesonide treated group (group B) and control group (group C). Blood PMN were isolated and purified. The expressions of MMP-9 were detected with immunocytochemical method in bl
5、ood PMN. The concentration of matrix metallo-proteinase inhibitor-1 (TIMP-1) was detected with ELISA. Results ：The level of MMP-9 in group A （0.1960.011，Optical density） were significantly higher than those in group C （0.1000.010）(P 0.01). Levels of MMP-9 in group B （0.1350.008） were significantly l
6、ower than those in group A， but higher than those in group C (all P 0.01). Levels of TIMP-1 in group A （34.964.54 ng/mL） were significantly higher than those in group C（26.143.43 ng/mL）(P 0.01). Levels of TIMP-1 in group B （29.582.41 ng/mL） were significantly lower than those in group A， but higher
7、than those in group C （P 0.05 or P 0.01）. There was significant positive correlation between the level of MMP-9 and TIMP-1(n =29，r =0.713，P 86%，瑞氏染色显示 PMN纯度89%。另抽血 1 mL静置后取血清，ELISA 法检测 TIMP-1蛋白的浓度。1.5 肺组织和支气管肺泡灌洗液（BALF）的制备 灌洗前先结扎左肺门，取左肺组织，经常规固定、石蜡包埋、切片，HE 染色 400倍光镜下观察肺组织的病理改变和炎性细胞浸润情况，免疫组织化学法测定 MMP-
8、9的表达。BALF 的留3取操作如下：气管插管，支气管肺泡灌洗 3次（每次 5 mL生理盐水） ，回收BALF，离心(4 ，3 000 r/min)10 min，沉渣经 PBS重悬后行细胞总数计数和分类计数。1.6 免疫细胞化学法 采用 SP法，操作按说明书进行。主要包括抗原修复，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶，兔血清封闭液，滴加一抗、二抗及链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物，DAB 显色、复染、封固，PBS 代替一抗进行阴性对照。每张细胞涂片随机计数 50个阳性细胞，Image-pro Plus 5.1免疫组化图像分析系统对阳性细胞进行灰度扫描，取其平均值代表该片的光密度（OD）值。1
9、.7 统计学处理方法 采用单因素方差分析法的 LSD法分析。两变量的相关分析采用直性相关分析法分析。2 结果2.1 肺组织病理改变 大鼠肺组织切片 HE染色显示：C 组细支气管形态规则、偶见炎性细胞浸润，管腔内见较少分泌物，上皮完整，肺泡形态规则；A 组可见细支气管形态不规则，见较多的炎性细胞浸润，管壁增厚，黏液栓形成，杯状细胞增生，部分支气管上皮细胞排列不完整、可见炎性细胞嗜上皮现象。B 组细支气管的炎症改变较 A组显著减轻。 2.2 BALF中白细胞计数 A组 BALF中细胞总数及淋巴细胞（LYM） 、PMN 和嗜酸细胞（EOS）的百分比均显著高于 C组（均 P 0.01） ，巨噬细胞（M
10、）的百分比显著低于 C组（P 0.01） 。与C组相比，B 组 BALF中细胞总数及 EOS、PMN 的百分比均显著升高（P 0.01或 P 0.05） ，M 的百分比显著降低（P 0.05） 。与 A组相比，B 组 BALF中细胞总数及 EOS、LYM 的百分比均显著降低（P 0.01或 P 0.05） ，M 的百分比显著升高（P 0.05）(见表 1)。2.3 PMN中 MMP-9的表达 阳性细胞的胞浆呈棕黄色表达，3 组中 PMN均有不同程度的表达。A 组中 PMN中 MMP-9的表达水平显著高于 C组（P 0.01） ，B组 PMN中 MMP-9的表达水平显著低于 A组且高于 C组（均
11、 P 0.01） （见表2、图 1） 。2.4 血清 TIMP-1的表达 A组血清 TIMP-1的表达水平显著高于 C组（P 0.01） ，B 组血清 TIMP-1的表达水平显著低于 A组且高于 C组（P 0.05或 P 0.01） （见表 2） 。2.5 MMP-9与 TIMP-1的相关性 MMP-9与 TIMP-1的表达水平呈显著正相关(n=29，r=0.713 P 0.01)。3 讨论哮喘是一种儿童时期常见的气道慢性疾病，涉及多种炎性细胞和炎性递质。一直以来，哮喘被认为主要是以 EOS浸润为主的气道慢性炎症，但最近研究发现4PMN同样具有不可忽视的作用。无论在哮喘急性发作期和致命性哮喘中，还是在轻度、中度和重度哮喘中，PMN 在气道黏膜中表达均增加。本科先前的研究表明，哮喘时 PMN处于激活状态，其分泌和黏附功能增加4。但 PMN能否通过 MMP-9参与哮喘的炎症过程，在国内尚未见报道。本研究通过复制大鼠哮喘模型，检测MMP-9在 PMN上的表达水平及布地奈德对其表达的影响，以及它与血 TIMP-1表达的相关性进行研究，探讨 PMN参与哮喘炎症的可能作用机制。本研究发现，哮喘组 BALF中细胞总数以及 EOS、PMN、LYM 占细胞总数的百分比均显著高于正常对照组，且光镜下也发现哮喘组肺组织炎症较正常对照组显著加重，表明
