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1、1囊性纤维化跨膜转导调节因子表达率与人精子受精能力的关系作者：李楚艳，李坤，陈璋辉，于建民，吕建新，倪崖【摘要】 目的?：研究人精子囊性纤维化跨膜转导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conduc-tance regulator，CFTR)表达率与精子受精能力间的关系。方法：运用间接免疫荧光法及蛋白印迹分析法研究 CFTR 在人精子上的表达及其在不同类型(生育组、不明原因性不育组及不育组)精子上的表达率情况。结果：通过间接免疫荧光法发现 CFTR 表达在人精子赤道板上，蛋白印迹分析进一步证实人精子中存在 CFTR，分子量为 170 kD;采用间接免疫荧光技术
2、，CFTR 在生育组、不明原因性不育组及不育组(包括畸形精子症、弱精症、少精症)上的表达率有显著差异：CFTR 在生育组精子上的表达率(88.13%3.79%)远高于不明原因性不育组(52.93%15.36%)及不育组(35.89%20.41%)(P?0.01)。结论：CFTR 表达率下降与人精子受精能力降低有关。 【关键词】 囊性纤维化跨膜转导调节因子;表达率;人精子;受精能力Abstract: ? Objective: To investigate the correlation between percentage of human sperm expressing CFTR and s
3、perm fertilizing capacity. Methods: The expression of CFTR on spermatozoa was conducted by indirect immunofluorescence staining and Western Blot Analysis. And the percentage of spermatozoa expressing CFTR from fertile， unexplained infertile and infertile men?(mainly teratospermic， asthenospermic and
4、 oligospermic)?was examined with indirect immunofluorescence staining. Results:CFTR protein was localized to the equatorial segment of sperm head and molecular weight was approximately 170 kD. And the percentage of spermatozoa expressing CFTR in fertile men was signifi-cantly different from that in
5、the unexplained infertile men and infertile men categories，the fertile men spermatozoa greatly higher?(88.13%3.79%)than that the unexplained infertile men (52.93%15.36%) and infertile men (35.89%20.41%) (P?0.01). Conclusion: The defective expression percentage of CFTR in human sperm is related to a
6、reduction of sperm fertilizing capacity.Key words: ? CFTR;expression percentage;human sperm;sperm fertilizing capacity囊性纤维化病(cystic fibrosis，CF)是由囊性纤维化跨膜转导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conduc-tance regulator，CFTR)基因突变引起的一种遗传性疾病，其临床表现是进行性肺衰竭、胰腺功能不全及两性不育等。2将近 97%男性 CF 患者因为先天性双侧输精管缺失(CBAVD)1-2、先天性
7、单侧输精管缺失(CUAVD)3及杨氏综合征(Youngs syndrome)4而致不育。Van der Ven 等5报道 17.5%男性不育是因为精子质量下降，14.3%少精症患者至少有一个 CFTR 基因突变，这些结果指出 CFTR 除了对附睾腺及输精管发生有重要作用以外，也可能参与精子的发生和成熟。我们以前的研究表明 CFTR 表达在精子赤道板上，且与小鼠精子生殖能力相关6，那么成熟人精子上 CFTR 表达率是否与精子生殖能力有关?CFTR 在精子上的表达率是否能作为评价精子受精能力的指标?为此我们进行了深入研究。1?材料和方法1.1?材料1.1.1?主要试剂：CFTR 抗体是从 Abca
8、m 公司(英国)购买的鼠源性单克隆抗体(CF3 Ab2784)，保存在-20 以备用。兔免疫前 IgG 购于 R&D Systems Inc(美国);鼠源 -actin 抗体为上海碧云天生物技术有限公司产品。辣根过氧化酶交联的羊抗鼠 IgG 以及 Alexa fluor 488 交联的羊抗鼠 IgG 均购自Molecular Probes 公司(美国)。Hochest 33258 购于 Sigma 公司(美国)。封闭用的羊血清由北京成文免疫研究室提供，硝酸纤维素膜购自 Bio-Rad 公司(美国)，X-胶片为日本富士株式会社产品。研究用的 100 mL PBS 工作液包含有 0.818 g N
9、aCl，0.02 g KCl，0.027 g KH2PO4，0.287 g Na2HPO412H2O。1.1.2?精液标本：根据 WHO 规定，本研究中正常精液参数标准：密度20106/mL;活力(a+b)%50%;正常形态%15%。生育男性(年龄在 2739 岁之间)是指其配偶在 1 年内已自然受孕且精液常规分析参数在正常范围之内的男性;不明原因性不育男性(年龄在 2341 岁之间)是指其配偶在没有采取任何避孕措施情况下 12 年内没有自然受孕的患者，但其精液常规分析参数在正常范围之内;不育男性(年龄在 2540 岁之间)指其配偶在没有采取任何避孕措施情况下12 年或 2 年以上没有自然受孕
10、的患者，并且其精液常规分析参数不在正常范围之内，包括畸形精子症(正常形态%15%)、弱精子症活力(a+b)%50%)和少精子症(密度20106/mL)。经浙江省医学科学院人类伦理委员会同意，生育组精液标本(n?=20)是生育男性手淫法取得的精液标本。不明原因性不育组(n?=25)精液标本及不育组(n?=55)精液标本均来自浙江大学附属邵逸夫医院生殖中心。每位患者都获得知情权，并填写了问卷调查以排除其他相关因素如年龄、工作条件、饮食习惯、吸烟情况、健康状况。各型精液参数见表 1。精液用 PBS液离心(1?800 r/min，5 min)洗 3 次去除精浆后用 4%多聚甲醛固定，4 过夜备用。1.
11、2?方法1.2.1?间接免疫荧光染色法：已固定的精液标本用 PBS 液离心(1?800 r/min，5 min)洗 3 次后涂于硅烷化玻璃片上，并于室温晾干。然后用 0.1% TritonX-100/PBS 破膜 10 min，用 PBS 液洗 3 次(5 min/次)。随后用 10%的羊血清在室温下封闭 1 h。弃去封闭液，将 CFTR 抗体(1:500) 溶于 10%羊血清中，加3在玻片上，置于 4 湿盒中(防止玻片干燥)反应过夜。第 2 天弃去一抗后用 PBS液洗 3 次(10 min/次)，在避光环境下将二抗(Alex fluor 488 交联羊抗鼠，1:500)稀释于 10%羊血清中
12、，加在玻片上，室温孵育 1 h。用 PBS 液洗 3 次(10 min/次)，DAPI(1g/mL)或 Hochest 33258(1g/mL)染色 10 min。然后用 PBS洗 3 次(10 min/次)，吹干后在荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i;Nikon Inc.，Tokyo，Japan)下观察。观察 200 个精子并计算 CFTR 在各类精子上的表达百分率。1.2.2?精子膜蛋白的提取：将人精子标本用预冷 PBS 液离心(1?800 r/min，5 min)洗 2 次，弃上清，精子沉淀加入适量 10% SDS 膜蛋白裂解液(精子数不超过 1106 cells/mL)，用
13、 1 mL 注射器(小号针头)反复抽打裂解液(室温)，直至液体不黏稠为止。离心(12?000 r/min，10 min)后，取上清，移入干净Eppendorf 管，置于 37 水浴中变性 2 h 后，加入 2上样缓冲液，混匀，分装，于-20 冰箱保存。1.2.3?蛋白印迹分析法：SDS-PAGE 的制备：安装玻璃板，先制备 15%分离胶 10 mL。灌注分离胶至梳齿下 1 cm，并在胶溶液上方覆盖异丙醇，压平凝胶，可见明显分层，室温下静置 45 min。待分离胶聚合完全后，制备 5% PAGE 积层胶 5 mL，倒出异丙醇，灌注积层胶，并插入干净的梳子，室温下聚合 30 min。将凝胶固定在电
14、泳装置上，电泳槽中加入 1Tris-甘氨酸电泳缓冲液，然后移出梳子。电泳：两孔分别上样 20g 和 40g 蛋白，并同时上样 5L 预染 Marker(Bio-Rad，USA)。开始时电压为 80 V，待溴酚蓝成一条线后，将电压增加到 100 V，直至 Marker 小分子蛋白明显分离。电转：卸下玻璃板，去除多余凝胶。合适大小的 PVDF 膜先在 100%甲醇溶液中浸泡 30?s，移入 1电转缓冲液平衡 30 min。将凝胶与滤膜紧贴，两侧各贴上一层滤纸(Extra thick，Bio-Rad)，夹在多孔海绵中，装置电转槽，于碎冰中，电转 90 min(恒流 200 mA)。封闭：电转结束后，
15、将 PVDF 印迹膜剪角标记方向，用 100%甲醇溶液浸泡 30 s，再用 TBS/T 洗膜 3 次，每次 10 min。然后放入封闭液中，水平摇床上室温孵 1 h。一抗孵育：弃去封闭液，加入一抗溶液(CFTR，1:1?000;-actin，1:1?000，用封闭液稀释)，4 摇床孵育过夜。弃去一抗溶液，用 TBS/T 溶液洗 3 次，每次 10 min。二抗孵育：加入二抗溶液(CFTR：辣根过氧化酶交联的羊抗鼠 IgG，1:1?000，-actin：辣根过氧化酶交联的羊抗鼠 IgG，1:2?000)，室温摇床孵育 1 h。弃去二抗溶液，用 TBS/T 溶液洗 3 次，每次 10 min。显影
16、：取 ECL 试剂 A 液、B 液等体积混合，加在膜上反应 2 min 后以保鲜膜包裹，压在 Kodak 胶片上，暗盒曝光 10 s3 min。胶片浸入显影液，一旦出现清晰条带中止显影。蒸馏水冲洗，浸入定影液 1 min，自来水冲洗、晾干。1.3?统计学处理方法?精子 CFTR 表达率采用单因素方差分析及 Dunnetts post hoc test 进行检验。2?结果2.1?CFTR 在人精子中的表达及定位?间接免疫荧光实验结果显示，CFTR 在人精子上有特异性表达，并定位于人精子头部赤道板上如图 1(A)。另外，我们用蛋白印迹分析实验进一步证明人精子中存在 CFTR 蛋白，分子量为 170 kD，两4个条带的蛋白上样量分别为 20g 和 40g 如图 1(B)。2.2?CFTR 在不同类型人精子上的表达?间接免疫荧光实验结果显示，CFTR在不同种类精子上的表达情况有显著差异如图 2(AC)。数
