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1、1嗜肺军团菌 ip 基因的克隆及其原核表达【摘要】目的 克隆嗜肺军团菌主要免疫原蛋白 ip 基因, 构建重组质粒pET-ip,并在原核系统中表达。方法 采用聚合酶链反应(PCR)， 从嗜肺军团菌基因组 DNA 中扩增军团菌主要免疫原蛋白 ip 基因 ,并将其定向克隆至原核表达载体 pET-32a(+),构建原核表达重组质粒 pET- ip,经限制性内切酶鉴定、PCR 及测序分析后,转化宿主菌大肠杆菌 BL21, IPTG 诱导表达,产物进行 SDS-PAGE 电泳、免疫印迹分析鉴定。结果 扩增出了 792 bp 完整的 ip 基因,构建的原核表达重组质粒 pET- ip 表达出 49 kDa
2、Trx-IP 的融合蛋白质，Westernblot 证实获得蛋白为所需要的目的蛋白。结论 成功构建了军团菌 ip 基因的原核表达载体, 并在大肠杆菌中得到了高效表达。 【关键词】 军团菌;ip 基因;克隆;基因表达Abstract: Objective To clone the ip gene of Legionella pneumophila, to construct recombinant plasmid and to detect its expression in prokaryotic cell. Methods The ip gene was amplified from the
3、 genomic DNA of Legionella pneumophila with PCR, and then was inserted into the prokaryotic expression vector pET32a(+).The prokaryotic expression recombinant plasmid pETip was constructed.After identification with restriction enzyme analysis, PCR and nucleotide sequencing analysis, the E. coli BL21
4、 containing the recombinant plasmid pETip was induced with IPTG. The expression of ip was subsequently detected by SDSpolyacrylamine gel electrophoresis and Westernblot analysis. Results The ip gene of 792 bp long was amplified and the recombinant plasmid pETip was constructed. SDSPAGE analysis show
5、ed that the Trx IP fusion protein of approximately 49 kDa in size was expressed. The expressed proteins could be confirmed by western blot. Conclusion The prokaryotic expression recombinant plasmid pETip was constructed successfully and its expressed efficiently in E. coli.Key words：legionella pneum
6、ophila；ip gene；clone； gene expression嗜肺军团菌是引起军团病的主要病原体，通过空气传播，进入呼吸道的病原体在肺泡上皮细胞和单核巨噬细胞内增殖而发病。随着人们生活水平的提高，其危害性日益受到关注，目前尚无理想的防治措施，研制有效的军团菌疫苗是十分必要。嗜肺军团菌主要免疫原基因 ip 编码产生的 29kDa 外膜蛋白（29 kDa immunogenic protein，IP） 1 ，为嗜肺军团菌 110 血清型所共有，具有种特异性，是机体免疫应答反应的主要免疫原。生物信息学分析显示其含有丰富的 B细胞、T 细胞表位，具有高度保守性，故选 ip 基因为构建 DN
7、A 疫苗抗原候选基因。本研究通过 PCR 扩增获得嗜肺军团菌 ip 基因，将其定向克隆入原核克隆载体 pET-32a(+)，构建重组质粒 pET-ip，经鉴定后,并使 ip 基因在原核系统中得2到表达，为进一步研究 IP 蛋白的结构、功能及其免疫原性和保护性功能等奠定基础。1 材料和方法1.1 材料嗜肺军团菌 L1 标准株及相应兔血清抗体由中国疾病预防控制中心传染病控制所惠赠。克隆宿主大肠杆菌 DH5a，质粒 pET-32a(+)均由本室保存；限制性内切酶 Hind 和 BamH 购自 TOYOBO,NEB T4DNA 连接酶购自基因生物技术有限公司，辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG(H+L)
8、及浓缩型 DAB 试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.2 方法1.2.1 嗜肺军团菌 ip 基因的 PCR 扩增接种嗜肺军团菌 L1 于 BCYE-a 琼脂培养基，37烛缸法培养 5 d 左右，收获细菌,提取其基因组 DNA2 。根据文献报道的 ip 基因序列1 ，自行设计合成扩增军团菌 ip 基因的引物，分别在 5 端加上限制性核酸内切酶 Hind 和BamH，引物序列如下：ip 的上游引物(P1):5-GGAAGATCTAAGCTT ATGGGAGGTTCAATGAG -3,ip 下游引物(P2): 5-TTAATAAGC GGATCC TTACCAGGCTGGTATTG- 3。配
9、制 50 L PCR 扩增体系：Ex Taq premix 25 L， Primer P1（50 pmol/L）1 L，Primer P2（50 pmol/L）1 L，基因组 DNA 1 L，灭菌蒸馏水 22 L。PCR 扩增设阴性对照，1 L 灭菌蒸馏水代替模板 DNA 建立扩增体系。扩增条件：94预变性 5 min；94变性 30 s，52 退火 45 s，72 延伸 60 s，30 个循环；最后 72延伸 5 min。反应结束后取 3 L 扩增产物，用 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.2 原核表达重组质粒 pET-ip 构建及鉴定分别将限制性核酸内切酶 Hind 和 BamH 消化
10、 PCR 扩增的 ip 基因和载体 pET-32a(+)适当比例混合，T4 DNA 连接酶 16连接过夜，转化 200 L 感受态 DH5a，37过夜培养，随机挑取单个菌落接种于 5 mL 含氨苄青霉素（60 mg/L）的 LB 培养液，增菌后以碱裂解法小量提取质粒,随后对所提质粒采用引物P1、P2 进行 PCR 扩增及用限制性内切酶 Hind 和 BamH 进行单、双酶切鉴定。1.2.3 基因序列测定取酶切及 PCR 鉴定阳性重组质粒的细菌，菌液送上海英骏生物技术有限公司，用通用引物对重组质粒 pET-ip 进行反向测序，对其进一步鉴定。31.2.4 pilE 基因的诱导表达将 pET-32
11、a(+)和 pET-ip 质粒转化到 BL21 细菌中，接种于 5 mL 含氨苄青霉素（60 mg/L）的 LB 培养液，培养至对数期(A550=0.6)，经终浓度为 1.0 mM 的IPTG 诱导，收集诱导 0、1、2、4、6h 的培养物，制备蛋白样品，经 10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶进行固定、考马斯亮蓝染色、脱色，拍照保存结果。1.2.5 Western blot 分析取适量诱导不同时间的蛋白样品进行 SDS-PAGE 电泳分离，浸渍转印法将蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上，将膜 4过夜封闭，洗膜，与 11000 稀释的兔血清（一抗）4过夜，再次洗膜，与 15000 稀释的辣根过氧
12、化物酶标记羊抗兔抗体(二抗)37 孵育 1 h，DAB 显色试剂盒显色，拍照保存结果。2 结果2.1 嗜肺军团菌 ip 基因的 PCR 扩增用引物 P1、P2 对嗜肺军团菌 L1 基因组 DNA 进行 PCR 扩增，1.0% 琼脂糖凝胶电泳分析，结果扩得一条约 790 bp 预期大小的产物条带；阴性对照无产物条带（图 1） 。2.2 pET-ip 的 PCR 及限制性酶切鉴定结果用引物 P1、P2 对所构建的重组质粒 pET-ip 进行 PCR 扩增，得到一条约790bp 的预期条带；用限制性内切酶 Hind 对所获得重组质粒 pET-ip 进行单酶切分析，电泳结果显示有对应约 6690bp
13、的条带出现；用 Hind 和 BamH双酶切分析，同一泳道可见约 5900bp 和约 790bp 的两个条带出现，分别与 pET-32a(+)空质粒和 ip 基因大小一致（图 2） 。2.3 ip 基因序列测定结果测序结果提交 GenBank 进行 Blast 比对分析。pET-ip 测序结果显示与嗜肺军团菌 L1 的 ip 基因具有 98%的同源性，12 个碱基位点发生突变(第 48 位 C-T，第 52 位 G-A，第 138 位 A-G，第 228 位 C-T，第 231 位 T-G，第 273 位 A-T，第357 位 A-T，第 382 位 A-C，第 405 位 A-T，第 552
14、 位 A-G，第 612 位 T-C，第678 位 C-A)，2 个氨基酸位点发生改变(第 18 位 V-I，第 128 位 I-L)，两个氨基酸都是同类氨基酸的相互替代，对蛋白质的空间结构和功能没有大的影响，基本上未影响抗原决定基。利用 NCBI 的 ORF finder 查找 ip 基因阅读框架，含完整ORF(open reading frame)，起始密码和终止密码，ip 基因片段长为 792bp，共编码 263 个氨基酸，推测相对分子质量约为 29 kDa。2.4 表达蛋白的 SDS-PAGE 检测4在 SDS-PAGE 凝胶电泳图上，经 IPTG 诱导，pET-ip 的宿主菌蛋白样品
15、在约49 kDa(标签 Trx.Tag 蛋白与 IP 蛋白形成的融合蛋白)处明显出现一条较浓重的条带；pET-32a(+)的宿主菌蛋白样品在约 20 kDa 处明显出现一条较浓重的Trx.Tag 条带，而未诱导样品均未见相应特异条带(图 3)。2.5 Western-blot 鉴定结果含有重组质粒 pET-ip 的 BL21 经 IPTG 诱导表达的产物在约 49 kDa 处出现一条特异性条带；而含有 pET-32a(+)的 BL21 诱导表达产物未检测到特异性杂交信号(图 4)。3 讨论29 kDa 蛋白是嗜肺军团菌的主要外膜蛋白，也是嗜肺军团菌含量最多的蛋白3 。蛋白免疫印迹检查结果表明，
16、嗜肺军团菌 110 血清型感染患者的血清，均与 29 kDa 蛋白抗原反应，呈阳性反应的血清用大肠埃希氏菌细胞吸收后，并不能消除 29 kDa 蛋白反应；用嗜肺军团菌 1 型菌细胞吸收后的阳性血清能消除29 kDa 蛋白反应4 。用直接免疫荧光法检测结果显示，嗜肺军团菌 1 型 29 kDa 蛋白的单克隆抗体能与嗜肺军团菌 1-10 型发生反应，其阳性率为 100%，与米克戴德军团菌、约旦军团菌、瓦茨沃斯军团菌、伯明翰军团菌、长滩军团菌均不发生反应，与肺炎链球菌、流感嗜血杆菌也不发生反应。1-10 型 LP 均有29kDa 外膜蛋白的存在，具有种的特异性4-5 。29 kDa 蛋白也是嗜肺军团菌致病因素之一，具有与宿主细胞黏附作用1 。嗜肺军团菌 29kDa 外膜蛋白也可与补体系统中的成分 C3b 和 C3bi 结合，介导调理素吞噬作用，从而使军团菌更易侵入宿主细胞。嗜肺军团菌的外膜蛋白可阻止吞噬细
