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1、,PacBio RS II第三代单分子实时测序2014-04,PacBio RS II单分子实时测序系统具有超常读长、组装结果高准确度、可检测碱基修饰等优势特点，可广泛应用于基因组测序、甲基化测序、全长转录本测序等项目。详见：http:/ RS II单分子实时测序原理PacBio RS II单分子实时测序（single molecule, real-time，SMRT）测序反应是在其专利SMRT cell中进行的，每个SMRT cell中有150,000个ZMW（纳米级的零模波导孔zero-mode waveguides）,每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链，SMRT Ce
2、ll能够平行检测大约75,000个单分子测序反应。当测序进行时，专利的包被技术保证DNA 聚合酶和模板形成的复合体被锚定在 ZMW 的底部，反应溶液中带有标记着不同荧光磷酸基团的高浓度核苷酸，检测装置则透过ZMW 底部的基层来实时观察 DNA 的合成过程，不同荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链时，其荧光可在DNA链检测到，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。,专利DNA 聚合酶不受激光对其造成的损伤及核苷酸标记荧光影响，可较长时间保持酶活性，实现超长读长，且当荧光标记的脱氧核苷酸与DNA链形成化学键时，DNA聚合酶可切除其荧光基团，荧光消失。ZMW外径比检测激光波长小，激光从底部打上去后不
3、能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围(体积20X 10-21 L)里,正好足够覆盖需要检测的部分，使得信号仅来自这个小反应区域，孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中，从而实现将背景降到最低。相机以15ms速度快速扫描整个阵列，检测特异性结合到DNA片断上的荧光碱基。此外，PacBio RS II测序可以通过检存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，如果碱基,PacBio RSII 测序优势,PacBio RS II 测序的应用,PacBio RS II测序系统无需PCR的
4、建库技术，大大减少了高GC基因组所带来的偏好影响；领先的超长测序，reads 读长4kb，有效提高基因组组装精准度和完整性，可更精确检测基因组变异及修饰情况，更适用于生物基因组研究。上海翰宇除了拥有常规的二代高通量测序平台Illumina HiSeq2500; MiSeq;454 GS-FLX Plus以外，我们还拥有华东地区第一台Pacific Biosciences公司研发的PacBio RS II 单分子实时测序系统。该测序平台应用与生物基因组测序，可得到最高的N50组装指标、最少的contigs数量和高达99.999%准确率的测序结果。同时，我们是目前国内做微生物测序最多的单位之一，已
5、经完成了400多株微生物基因组测序，近100株细菌的完成图，合作单位发表的 SCI 文章已有30余篇，具有丰富的专业分析经验。,基因组测序,转录组测序是指利用高通量测序技术对cDNA进行测序从而得到一个样品中所有RNA的信息，得到基因的全长转录本是科学研究工作者梦寐以求的测序结果，但碍于现有序列拼装技术限制，得到全长转录本的数量、准确度和完整性大打折扣，PacBio RS II测序平台，可根据不同实验目的，构建不同cDNA文库，借助其超长读长优势，一次性得到更精准完整的全长转录本。,全长转录组测序,表观遗传学研究是现代科学研究热点，全基因组上的甲基化修饰检测更是热点中的焦点，PacBio RS
6、 II根据修饰碱基与未修饰碱基通过聚合酶的动力学变化，识别碱基修饰情况。PacBio RS II目前可检测甲基化修饰类型包括：4mC,6mA,5mC； 优势：无需进行DNA扩增，可检测甲基化与半甲基化位点；单碱基分辨率；无需专门处理，可直接进行碱基修饰检测测序；可发现未知修饰；,碱基修饰测序,PacBio RS II样本准备要求,一、测序所需样品量 所需的测序样品的量会根据SMARTBell模板制备时插入片段的大小不同而不同。根据样品的提取质量，在片段化以及检测浓度的过程中，大概会有20%的样品损失。因此，请确保有足够的起始DNA样品从而可以进行后续的流程。二、样品要求,1. DNA样品纯度：
7、260/280比值接近1.8，260/230比值为2.02.2,2. DNA样品浓度：对于PacBio测序的样品，建议使用PicoGreen染色或用Qubit分光光度计（Life Technology）进行检测,三、样品储存和运输要求1. DNA样品可溶解于Tris缓冲液中（如10mM Tris，PH为7.08.0）或无核酸酶的水中，样品的最大体积不得超过130ul，溶解用的缓冲液中不含EDTA。2. 纯化的DNA样品非常稳定，建议以冷冻（干冰）的方式运输样品，一方面保证无细菌污染，另一方面也可以减少样品的挥发。,3. 确保样品为双链DNA。单链DNA不能进行SMARTBell模板制备，且会影
8、响定量和聚合酶的结合,4. 尽量避免样品多次冻融，确保样品没有在大于65度的环境中放置，没有暴露在高酸性或高碱性条件下(PH 9)和UV环境下。,5. 确保样品不含有不溶的物质，RNA，螯合剂（如EDTA），二价金属阳离子（如Mg2+），变性剂（如胍盐，苯酚）或去污剂（SDS，Triton-X 100）。,四 、操作DNA时的注意事项1. 乙醇沉淀后避免DNA过于干燥，让DNA在空气中自然干燥。2. 应使用RNA ase-free的水或其他适合的溶液溶解DNA。3. 为帮助DNA溶解，可小心翻转小管数次，或用手指轻弹管的底部，或者也可以将样品放置于2-8度的环境下过夜溶解。 5. 请勿涡旋震荡DNA样品，因为该操作会导致DNA片段化。6. 将DNA样品在65度加热10分钟，以使DNASE失活。确保加热时间不超过10分钟，否则可能导致DNA的损伤。同时，请勿反复冻融DNA样品。,
