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1、15基于ITS序列和RAMS标记分析青枯雷尔氏菌的遗传多样性*郑雪芳，车建美，林营志，蓝江林，刘波*基金项目：国家863计划项目（2006AA10A211）农作物重大病害多功能广谱生防菌剂研究和创制；福建省财政专项-福建省农业科学院科技创新团队建设基金（STIF-Y03）；福建省青年科技人才创新项目（2003.J046）。作者简介：郑雪芳，女，1977年生，硕士。 E-mail： *通迅作者。Author for correspondence。博士，：刘波博士、研究员，从事微生物生物技术和生物农药研究。，Tel:13905917339; E-mail: , （福建省农科院生物技术研究所，福
2、州 350003）摘 要：应用ITS序列和RAMS（Random amplified microsatellites）技术对福建省不同地域和，不同寄主作物的青枯雷尔氏菌进行遗传多样性研究。结果表明，供试的21株青枯雷尔氏菌的ITS区序列有3种类型，这3种类型菌株的ITS序列只有1-2个碱基的差异，与参比菌株GMI1000的ITS区序列或者相同或者有1-2个碱基的差异。在此基础上，利用RAMS技术进一步分析表明，供试的青枯雷尔氏菌及参比菌株GMI1000的基因组DNA间存在丰富的多态性。聚类结果显示，供试菌株可聚为3个类群，同一寄主作物的菌株聚在同一类群中，同一地理来源的菌株聚在同一亚类群中，说
3、明青枯雷尔氏菌的遗传分化与寄主作物和地理来源都存在相关性，与寄主作物的关系更密切。关键词：青枯雷尔氏菌；遗传多样性；ITS序列分析；RAMS标记Genetic Diversity Analysis of Ralstonia Solanacearum solanacearum Based on RAMS Marker and ITS SequenceZHEN Xue-Fang, CHE Jian-Mei , LIN Ying-Zhi,Lan Jiang-lin,LIU Bo(Biotechnology Institute，Fujian Academy of Agricultural Scienc
4、es，Fuzhou 350003，China)Abstract: Genetic diversity among 21 strains of Ralstonia solanacearum from different climate zones and different host crop was analyzed by ITS sequence and RAMS methods respectively. Three types of ITS sequence were obtained. Among them, there was only one or two base diversi
5、ty, and ITS sequence of tested strains was the same to GMI1000 or one or two base difference to GMI1000.The total genomic DNA was then examined by sensitive Random amplified microsatellitesRAMS（ RAMS Random amplified microsatellites）RAMS technique. The results revealed an obvious diversity of their
6、genomic DNA. Cluster analysis based on the RAMS bands showed that tested isolates could be separated into 3 clusters.The strains come from the same host crop were clustered into one group, and the strains come from the same climate zones were belonged to the same subgroup.It is concludedResult of th
7、is study suggested that genetic diversity variation of R.solanacearum was related tocomes from different host crop and different climate zones, mostly comes from differenclosely related tot host crop.Key words：Ralstonia solanacearum；Genetic diversity；ITS sequence；RAMS marker细菌性青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia
8、solanacearum）引起的毁灭性植物病害，广泛分布于热带、亚热带及温带地区，在我国南方各省市均有严重发生。已报道的发生青枯病的植物有44个科，300多个种（刘波等, 2005；Middleton and Hayward, 1990；康耀卫和毛国璋, 1994） 13，包括茄科植物、木麻黄属、鹤望兰属、姜属、芭蕉属、花生等。许多经济地位很重要的作物如马铃薯、番茄、烟草、香蕉及部分贵重药材和花卉均受其害，是生产上主要的限制因子。研究青枯雷尔氏菌的遗传多样性对于了解青枯病的发生、流行，并对其进行病害的及时防治具有十分重要的意义。现已建立一系列分析青枯雷尔氏菌遗传多样性的方法，例如，seal e
9、t al.（1992等）4，用RNA保守物PCR技术将来源不同的112个青枯雷尔氏菌划分为3个“指纹”组，结果与COOK et al.（1989等）5报道的利用RFLP技术获得的青枯雷尔氏菌“区组”相吻合。Gilling 等6et al.（1993）通过对扩增的多聚半乳糖醛酸酶基因片段RFLP分析，将来源不同的48个青枯雷尔氏菌分离的分为6个RFLP型；Julin et al.（1995）等7应用RC-PFGE和REP-PCR技术研究了46个肯尼亚青枯雷尔氏菌分离物及39个来自不同国家菌株的遗传多样性，并进行了“分型”，前人研究表明了青枯雷尔氏菌DNA存在丰富的遗传多样性。本研究文在以往研究基
10、础上，采用ITS序列分析法结合RAMS（Random Ampilified Microsatellite，随机扩增微卫星）技术对福建省内不同地区、不同寄主作物来源的青枯雷尔氏菌的遗传分化进行研究，利用RAMS方法对青枯雷尔氏菌进行DNA多态性分析，未见相关报道。RAMS技术最初由Zietkiewicz等（1994）报道，Hantula等（1996）首次应用菌物研究中，但还未见应用于青枯雷尔氏菌的遗传多样性研究。1材料与方法1.1菌株及培养基 供试菌株及来源详见表1，参比菌株GMI1000由福州大学生物科学与工程学院馈赠。菌株采用TTC培养基：葡萄糖0.5%、蛋白胨1.0%、水解酪蛋白0.1%、
11、琼脂1.7%；另配制1.0%TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）溶液，121灭菌2-8min分钟；然后每100mLl培养基加入1.0%TTC溶液0.5mLl，即配制成TTC培养基，冷却至60后制平板备用，TTC液体培养基与固体基本相同，只是不加琼脂。表1 供试菌株及来源Tab.1 Strains used in this studyNO.Strain numberHostStrainLocation1.1101番茄TomatoRs-F.351144-060928-13VPutian2.1102Rs-F.351144-060928-14VPutian3.442Rs-F.352300-06072
12、2-5-1-1Ningde4.443Rs-F.352300-060722-5-1-2Ningde5.445Rs-F.352300-060722-5-2-2Ningde6.1103茄子EggplantRs-Q.351144-061019-01VPutian7.1104Rs-Q.351144-061019-02VPutian8.1105Rs-Q.351144-061019-03VPutian9.452Rs-Q.352300-060722-8-1-1Ningde10.454Rs-Q.352300-060722-8-2-2Ningde11.456Rs-Q.352300-060722-9-1-2Ning
13、de12.458Rs-Q.352300-060722-9-2-2Ningde13.459辣椒PepperRs-L.352300-060722-14-1-1Ningde14.462Rs-L.352300-060722-14-2-2Ningde15.463Rs-L.352300-060722-15-1Ningde16.465Rs-L.352300-060722-16-1-1Ningde17.468Rs-L.352300-060722-16-2-2Ningde18.470Rs-L.352300-060722-17-1-2Ningde19.474Rs-L.352300-060722-18-2-1Nin
14、gde20.475Rs-L.352300-060722-18-2-2Ningde21.476Rs-L.352300-060722-20-1NingdeRs代表Ralstonia solanacearumRS showed Ralstonia solanacearum1.2 菌株基因组DNA制备 采用CTAB法（Ausubel et al., 1998）(Hexadecyltrimethylammoniumbromide) 8提取菌株DNA。1.3 ITS-PCR扩增的引物设计青枯雷尔氏菌标准菌株GMI1000是一株从番茄上分离到的青枯病原菌， 它的基因组大小为5.8Mb，由两个复制子组成：一个
15、3.7 Mb染色体和一个2.1 Mb巨型质粒。菌株GMI1000基因组中含有与G+C偏差比率相关的可遗传移动元件的区域，可能在基因组进化中起着重要的作用。本研究根据参比菌株GMI1000 ITS1区序列（由Genbank上获取）设计引物扩增供试菌株的16S和23S之间的ITS1区序列，预计扩增片段范围长度为620bp，其中ITS1区序列长度为502bp。引物序列Pf：GCCAAGGCATCCACCACA，Pr：AGGAGGGCGATTACCACG。图1 ITS1区PCR扩增引物设计示意图Fig. 1 Sketch of showing the positions of PCR amplification primers of ITS1 region1.4青枯雷尔氏菌ITS-PCR特异扩增青枯雷尔氏菌ITS-PCR扩增体系体系为：扩增总体积为25 L，包括1个单位的Taq酶， 2.5 L的10PCR Buffer，0.5L的10 mmol/LM的4种 dN
